Stimulation de la cytoplasmiques ADN de détection Pathways<em> In Vitro</em> Et<em> In Vivo</em
Summary
L'objectif du protocole est d'utiliser des méthodes optimales pour stimuler les voies cytoplasmiques ADN de détection dans les cellules et in vivo. Ce résultat est obtenu en améliorant le temps de génération de l'ADN double brin au cours de la ligature d'extrémités franches. Les cellules et les souris sont ensuite transfectées en utilisant un réactif de transfection lipidique.
Abstract
Afin de stimuler efficacement une réponse immunitaire innée, l'ADN doit être d'une longueur et une pureté suffisante. Nous présentons une méthode où l'ADN double brin (ADN double brin) qui a les caractéristiques requises pour stimuler l'ADN cytoplasmique voies de détection peuvent être générés à moindre coût et en toute simplicité. Par la concatémérisation de courts oligonucléotides synthétiques (qui n'ont pas de motifs CpG), l'ADN double brin peut être généré pour avoir une longueur suffisante pour activer la voie de l'ADN de détection cytosolique. Ce protocole implique de ligature d'extrémités franches les oligonucléotides en présence de polyéthylène glycol (PEG), qui fournit un environnement efficace pour la liaison de se produire. Les concatémères ADN double brin peuvent être utilisés, après purification par extraction au phénol / chloroforme, pour simuler la réponse immunitaire innée in vitro par des protocoles de transfection standard. Cet ADN peut également être utilisé pour stimuler l'immunité innée in vivo par injection intradermique dans le pavillon de l'oreille d'une souris, par exemple. Parstandardisation du processus de concatémérisation et les protocoles de stimulation ultérieures, une activation fiable et reproductible du système immunitaire inné peut être produit.
Introduction
ADN est un élément essentiel de tous les organismes et les cellules eucaryotes, qui maintiennent dans des compartiments spécifiques. Une fonction du système immunitaire inné est de déterminer quand tel cloisonnement tombe en panne ou lorsque le matériau étranger est introduit dans l'organisme par une violation des obstacles externes, physiques. Dans le corps humain, il existe un certain nombre de protéines qui existent à l'aide de petites quantités de dégradation de l'ADN qui peut échapper à la bonne cloisonnement; DNAse I, II, et III défoncer ADN dans le plasma, endosome, et le cytosol, respectivement. Cependant, il a été démontré que des souris dépourvues de DNAse II meurent d'une anémie sévère provoquée par une production excessive d'interférons 1 suggérant que le système immunitaire inné répond à l'ADN extra-nucléaire. Cette réponse se produit même chez les souris qui sont entièrement déficiente de la capacité de signalisation du récepteur Toll-like. De nombreuses études ont maintenant démontré que stimulateur de gènes d'interféron (Sting) 2 et le réservoir de liaison kinase 1 (TBK1) 3 sont impliqués dans la détection de l'ADN dans le cytoplasme et que cette voie de signalisation active le facteur de régulation de l'interféron (IRF) -3 4. La transcription de IRF3 dépendante subséquente des cytokines, des chimiokines, des gènes de l'interféron et est caractéristique d'une réponse immunitaire innée, soit à un agent pathogène ou d'un danger associé à motif moléculaire (PAMP ou DAMP) 5.
Le désir d'étudier intracellulaires voies de détection de l'acide nucléique a conduit à la nécessité de développer des méthodes robustes et reproductibles pour la stimulation des cellules par l'introduction d'ADN ou d'ARN dans les cellules sans activer d'autres réponses immunitaires innées. Un procédé par lequel le / TBK1 / voie de IRF3 de piqûre peut être stimulée est d'utiliser cationiques réactifs de transfection lipide pour délivrer un acide nucléique dans le cytoplasme où il peut être accédé par des capteurs de l'ADN comme l'ADN-PK, IFI16, et CGA 8.6.
Les caractéristiques de l'ADN qui sont actuellement comprises pour permettre effactivation isant de la réponse immunitaire innée cytoplasmique sans stimulation d'autres voies sont sa longueur, la masse, la pureté et l'absence de motifs CpG 4,7,9. Les oligonucleotides synthétiques sont très convenable pour le but de générer une réponse immunitaire innée, car ils permettent la séquence d'ADN devant être optimisée et préparée comme une espèce chimique pur. Un ADN (ISD) séquence d'immuno-stimulation de 45 paires de bases a été identifié par Stetson et al. 4 comme étant une séquence appropriée, sans CpG à cet effet. Cette séquence d'ADN double brin est par ailleurs aléatoire et n'a pas de caractéristiques spécifiques au-delà de son manque de motifs CpG. Nous avons découvert que par l'oligonucléotide concatemerizing ISD significativement plus longues en brins augmente la grandeur de la stimulation 7. La génération d'ISD concatemerized est donc utile pour stimuler une réponse immunitaire innée cytoplasmique. Nous présentons ici les protocoles pour la préparation de ce réactif et comment il peut être utilisé pour activer la voie de l'ADN de détection envitro ainsi que in vivo.
NOTE: Toutes les études animales sont réalisées selon des protocoles approuvés institutionnels et les lignes directrices de soins aux animaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles décrits ici sont utilisés pour générer l'ADN double brin à stimuler la réponse immunitaire innée cytosolique avec des résultats reproductibles dans une large gamme de types de cellules et in vivo. Etant donné que le réactif principal de substrat utilisé est un oligonucléotide synthétique, une certaine souplesse dans ce système pour l'utilisation de séquences d'ADN ou d'autres modifications chimiques. Il est possible, par exemple, à la place de l'oligonucléotid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs n'ont aucun remerciements.
Materials
| Forward Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGATCTACA |
| Reverse Primer | Integrated DNA technologies | n/a | TGTAGATCATGTACAGATCAGTCATAGATCACTAGTAGATCTGTA |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P-4463 | |
| Molecular biology grade water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| T4 Polynucleotide Kinase | Promega | M4101 | |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | |
| Phenol:Chloroform | Fisher Chemical | BPE1752p-400 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C/4960/PB08 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| DNA gel loading buffer | New England biolabs | B7021S | |
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Optimem | Life Technologies | 11058021 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bioscience | MIR 2300 | |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 80901 Model 1705 | |
| 30G needles | BD bioscience | 304000 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Oligo(dT) primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| dNTP mix | Fermentas | R0192 | |
| Super Script III reverse transcriptase | Life Technologies | 56575 | |
| First strand cDNA synthesis buffer | Life Technologies | y02321 | |
| SybrGreen qPCR Fast master mix | Applied Biosystems | 4385612 | |
| cxcl10 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | ACTGCATCCATATCGATGAC |
| cxcl10 murine reverse primer | Integrated DNA technologies | n/a | TTCATCGTGGCAATGATCTC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
| il6 murine forward primer | Integrated DNA technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
References
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