ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出
Summary
Abstract
ヒト多能性幹細胞（hPSCs）は皿にヒト疾患をモデル化するためと病気や事故後の再生アプリケーション用の移植可能な細胞の供給源として、人間の胚発生を研究するための大きな可能性を秘めている。神経冠（NC）細胞は、末梢神経系およびグリア、メラノサイトおよび間葉細胞からの細胞などの成体の体細胞の多種多様のための前駆体である。彼らは、細胞運命の仕様および移行を含むヒト胚発生の側面を研究する細胞の貴重な情報源である。最終分化した細胞型へNC前駆細胞のさらなる分化は、 インビトロでのヒト疾患をモデル化する病気のメカニズムを調査し、再生医療用の細胞を生成する可能性を提供する。この記事ではhPSCsからNC細胞の誘導のために現在利用可能なin vitroでの分化プロトコルの適応を提示します。この新しいプロトコルは、diffeの18日間を必要とするrentiationは、フィーダーを含まない、ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）ラインだけでなく、人間の人工多能性幹細胞（hiPSC）ラインのうち、容易に拡張性の高い再現性がある。新旧両方のプロトコルが同じアイデンティティのNC細胞を得る。
Introduction
ヒト胚性幹細胞（hESC）およびヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）は、良好な動物モデルでも、一次組織のいずれもが利用可能なヒト疾患の研究および将来の治療のための、特に、巨大な可能性を示している。ヒトES細胞/ hiPSC技術の応用例としては、以下の通りである：特定の目的の細胞は無制限数量1で、再生医療のためのhESC / hiPSCsから生成することができます。細胞は、特定の疾患を有する患者から製造し、インビトロ疾患モデル2,3 に確立するために使用することができる。このような疾患モデルは、新しい薬剤化合物の探求4並びに有効性および毒性5のための既存の薬物の試験に大規模な薬物スクリーニングに用いることができる。 インビトロ疾患モデルは、新規な病気のメカニズムの同定につながる可能性がある。ヒトES細胞/ IPSC技術のすべてのアプリケーションに対して、特定と連携することが重要で、よく定義関心対象の疾患において影響d個の細胞タイプ。このように、固体で再現性のin vitroでの分化プロトコルの利用可能性は、ヒトES細胞/ hiPSC技術のすべてのアプリケーションのために重要である。プロトコルは、ヒトES細胞/ hiPSCラインと異なる研究者間の最小の変動、時間費用、労力、難しさやコストだけでなく、最大の再現性を示すことが望ましい。
神経冠（NC）細胞は、表皮と神経上皮間脊椎動物神経胚形成の間に出現する。それらは増殖し、胚全体に広範囲に移動し、骨/軟骨、頭蓋顔面骨格、感覚神経細胞、シュワン細胞、メラニン細胞、平滑筋細胞、腸、ニューロン、自律ニューロン、クロム親和細胞を含む、子孫細胞型の印象的な多様性を生じさせる、心臓中隔細胞、歯および副腎/甲状腺腺細胞6。このため、NC細胞が魅力的な、細胞幹細胞のフィールドの型とするために重要であるこのようなヒルシュスプルング病7、家族性自律神経失調症8などの疾患、ならびに神経芽細胞腫9のような種々の癌のモデル化。さらに、それらは、 インビトロでヒト胚発生の局面を研究する可能性を提供する。
現在利用可能な、広くhESCの10,11からNC細胞の誘導のためにインビトロで分化プロトコルにおいて適用分化の35日まで必要とし、例えば、MS5細胞などの間質フィーダー細胞上で神経誘導を伴い、従って、あまり明確でない条件下で行われる。それはNC細胞を大量に生成するためにアップスケールすることができるが、ハイスループット薬剤スクリーニング4に必要な、例えば、これは、手間とコスト集約的である。さらに、再現が困難であることができる、神経ロゼットの手動継代を伴うので、それはのhESCまたはhiPSCの多種多様に適用する場合、特に、全体的な変動を受けるライン。ここでは、フィーダー細胞を含まない18日間プロトコルにおけるNC細胞の段階的な導出を示す。このメソッドは、現在使用されているプロトコルよりも短く、より定義されています。さらに、異なるhiPSC系統のうちNC細胞を生成する際に非常に堅牢である。重要なのは、それが両方のプロトコルによって得られたNC細胞は、神経ロゼット（以下と呼ばれるロゼット-NCまたはR-NC）の境界に出現することが示されている。 2つのプロトコルのうちいずれかを使用して得られた細胞は、同じNCマーカーを発現し、マイクロアレイ解析で一緒にクラスター化、形態学的に同じに見える。新しいプロトコル（R-NC）を用いてNC由来細胞は、それらが移動し、さらに神経細胞に分化することができるように古いプロトコル（MS5-R-NC）を用いてNC由来細胞と同様の機能である。したがって、細胞は、MS5-R-NC細胞と併用して用いることができる。ヒトES細胞/ IPSCからNC細胞の誘導のために、R-NCセルプロトコルは、NC系統が関与するヒトES細胞/ IPSC技術のすべてのアプリケーションに有用である。</ pの>
Protocol
Representative Results
Discussion
ヒトES細胞/ hiPSCsからのR-NC細胞の正常な分化のために、次の点に注意して行ってください。これは、常に無菌培養条件の下で動作することが重要である。特に、この汚染が成功分化の妨げになることから、定期的にマイコプラズマ汚染のためHPSC培養をテストすることが重要ですが、容易にHPSC培養で視覚的に検出することができません。 R-NC分化が90〜100％の細胞密度で開始されるべきである;?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
そしてトライ制度幹細胞イニシアチブ（スター財団）;この作品は、スイス国立科学財団からNYSTEM（C026447 C026446）からの補助金を通じて先進的な研究者のためのフェローシップでサポートされていました。
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
