인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포
Summary
Abstract
인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 접시에 인간의 질병을 모델링하고 질병이나 사고 후 재생 응용 프로그램에 이식 가능한 세포의 원천으로, 인간의 배아 발달을 연구하기위한 큰 잠재력이있다. 신경 능선 (NC) 세포는 말초 신경계 및 아교, 멜라닌 세포 및 간엽 세포에서 세포와 같은 성숙한 체세포 많은 다양한 대한 전구체이다. 그들은 세포의 운명 사양 및 마이그레이션을 포함하여 인간의 배아 발달의 측면을 연구하는 세포의 중요한 원천입니다. 말단 분화 세포 유형으로 NC 전구 세포의 분화는 또한, 시험 관내에서 인간의 질병을 모델링 질병 메커니즘을 조사하고 재생 의료용 세포를 생성 할 수있는 가능성을 제공한다. 이 문서 hPSCs에서 NC 세포의 유도에 대한 현재 사용할 수있는 체외 분화 프로토콜의 적응을 선물한다. 이 새로운 프로토콜은 diffe 18 일이 필요합니다rentiation는 장치가없는 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 라인뿐만 아니라 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 선 사이에서 쉽게 확장 가능하고 높은 재현성이다. 과거와 현재 프로토콜은 동일한 정체성 NC 세포를 얻을 수 있습니다.
Introduction
인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC는) 좋은 동물 모델도 기본 조직이 모두 사용할 수있는 인간의 질병의 조사와 미래의 치료에 특히 엄청난 잠재력을 보여 주었다. hESC의 / hiPSC 기술의 적용 예는 다음과 같습니다 특히 관심의 세포는 무제한 수량 1에서 재생 의학에 hESC의 / hiPSCs에서 생성 할 수 있습니다. 세포는 특정 질환을 운반 환자에서 생산하고 시험 관내 질병 모델에서 2,3 확립하는데 사용될 수있다. 이러한 질병 모델은 신약 화합물 4에 대한 탐구뿐만 아니라 효능과 독성 5에 대한 기존의 약물 테스트에서 대규모 약물 검사를 위해 사용될 수있다. 체외 질병 모델이 새로운 질병 메커니즘의 식별로 이어질 수 있습니다. hESC의 / IPSC 기술의 모든 애플리케이션에 특정 작업을하는 것이 중요하다, 잘 정의그 질병에 영향을 D의 세포 유형. 따라서, 고체 및 재현 시험 관내 분화 프로토콜의 가용성은 hESC의 / hiPSC 기술의 모든 응용 프로그램에 대해 매우 중요합니다. 프로토콜의 hESC / hiPSC 라인과 다른 연구자들 사이 최소한의 변화, 시간 비용, 노력, 어려움과 비용뿐만 아니라 최대 재현성을 표시하는 것이 바람직하다.
신경 능선 (NC) 세포는 표피와 신경 상피 세포 사이의 척추 neurulation 동안 등장. 그들은 증식과 배아에 걸쳐 광범위하게 마이그레이션 및 뼈 / 연골, 두개 안면 골격, 감각 신경, 슈반 세포, 멜라닌 세포, 평활근 세포, 장내 신경, 자율 신경, 크롬 친화 세포를 포함, 자손 세포 유형의 인상적인 다양성을 일으키다 , 심장 중격 세포의 치아와 부신 / 갑상선 선의 세포 6. 따라서, NC 세포 매력적인 셀 줄기 세포들에 대한 분류 및 위해 중요이러한 Hirschsprung의 질병 7, 가족 성 자율 신경 8뿐만 아니라 신경 모세포종 9로 암과 같은 질병의 다양한 모델링. 또한, 그들은 체외에서 인간의 배아 발달의 양상을 연구 할 수있는 가능성을 제공합니다.
현재 널리 인간 배아 줄기 세포 (10, 11)에서 NC 세포의 유도에 대한 시험 관내 분화 프로토콜에 적용 분화 35 일까지 요구하고는 MS5 세포와 같은 기질 피더 세포에 신경 유도를 포함하고, 따라서 제대로 정의되지 않은 조건에서 수행된다. 이 NC 세포를 대량으로 생성하는 스케일 업 할 수 있지만, 높은 처리량 약물 스크리닝 4 필요한 예를 들어, 이는 노동 및 비용 집약적이다. 또한, 재현하기 어려울 수 있습니다 신경 근엽, 수동 계대을 포함하고는 hESC의 또는 hiPSC의 큰 다양성에 적용 할 경우, 따라서 특히 전반적인 변동성이 적용됩니다선. 여기서, 피더 세포의 자유 18 일간 프로토콜 NC 세포의 단계적 유도가 도시된다. 이 방법은 현재 사용되는 프로토콜보다 더 짧고 더 정의된다. 또한, 다른 hiPSC 라인 구비 NC 세포 생성에 매우 강력하다. 중요한 것은이 두 프로토콜에 의해 산출 NC 세포가 신경 근엽 (이하 불리는 장미-NC 또는 R-NC)의 경계에서 나오는 것을 알 수있다. 이 프로토콜을 사용하여 유도 된 세포들은 동일한 NC 마커를 표현하고 마이크로 어레이 분석에 함께 클러스터 형태 학적으로 동일하게 보인다. 새로운 프로토콜 (R-NC)를 사용하여 유도 된 NC 세포들은 마이그레이션 및 상기 뉴런으로 분화 할 수 있도록 이전 프로토콜 (MS5-R-NC)를 사용하여 유도 된 NC 세포와 유사한 기능이다. 따라서 세포는 MS5-R-NC 세포와 동시에 사용될 수있다. hESC의 / IPSC에서 NC 세포의 유도를위한 R-NC 세포 프로토콜은 NC의 혈통을 포함 hESC의 / IPSC 기술의 모든 응용 프로그램에 도움이 될 것입니다. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
hESC의 / hiPSCs에서 R-NC 세포의 성공적 분화를 들어 다음과 같은 고려 사항이되어야한다. 그것은 항상 무균 배양 조건에서 작동하는 것이 중요합니다. 특히,이 오염이 성공적 분화를 방해 할 것이기 때문에, 정기적으로 마이코 플라스마 오염 hPSC 배양 물을 시험하는 것이 중요하지만, 좀처럼 hPSC 배양 시각적 검출 될 수 없다. R-NC 차별화 90-100% 세포 밀도에서 시작되어야한다; 낮은 세포 밀도는 세포의…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
및 트라이 제도 줄기 세포 이니셔티브 (스타 재단)이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서와 NYSTEM (C026447 C026446)에서 교부금을 통해 고급 연구자를위한 친교에 의해 지원되었다.
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
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