القدرة على رصد استجابات الخلايا التائية بالتفصيل في الجسم الحي المهم لتطوير فهمنا للاستجابة المناعية. نحن هنا وصف استخدام صفائف الهدف الفلورسنت (اتفاقيات التجارة الحرة) في الجسم الحي في فحص الخلايا التائية التي يقيم> 250 معلمات في وقت واحد من قبل التدفق الخلوي.
القدرة على رصد استجابات الخلايا T في الجسم الحي المهم لتطوير فهمنا للاستجابة المناعية وتصميم المناعية. نحن هنا وصف استخدام الفلورسنت مجموعة المستهدفة (FTA) والتكنولوجيا، التي تستخدم الأصباغ الحيوية مثل استر carboxyfluorescein succinimidyl (CFSE)، البنفسجي ليزر الأصباغ منفعل (CellTrace فيوليت: CTV) والليزر الحمراء الأصباغ منفعل (خلية انتشار صبغ eFluor 670: وثيقة البرنامج القطري ) لcombinatorially الخلايا الليمفاوية الماوس في التسمية> 250 ملحوظ مجموعات الخلايا الفلورسنت. مجموعات الخلايا داخل هذه اتفاقيات التجارة الحرة يمكن نابض مع التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) من الدرجة الأولى والدرجة MHC-II الببتيدات ملزمة، وبالتالي تكون بمثابة خلايا CD8 + الهدف لوخلايا CD4 + T، على التوالي. تبقى هذه الخلايا قابلة للحياة واتفاقية التجارة الحرة تعمل بكامل طاقتها، وبالتالي يمكن أن تدار في الفئران للسماح تقييم CD8 + T قتل بوساطة خلية من الخلايا المستهدفة اتفاقية التجارة الحرة وCD4 + T-هيل التأمل الخليةp من اتفاقية التجارة الحرة B الخلايا المستهدفة خلية في الوقت الحقيقي في الجسم الحي بواسطة التدفق الخلوي. منذ> 250 الخلايا المستهدفة يمكن تقييمها في وقت واحد، والأسلوب يسمح رصد استجابات الخلايا T ضد عدة الحواتم المستضد في عدة تركيزات ومكررات متعددة. على هذا النحو، يمكن للتقنية قياس استجابات الخلايا التائية في كل من الكمية (على سبيل المثال حجم التراكمي للاستجابة) والنوعية (على سبيل المثال. الطمع وظيفية وحاتمة عبر التفاعل من الاستجابة) المستوى. هنا، نحن تصف كيفية بناء هذه اتفاقيات التجارة الحرة وتعطي مثالا على الكيفية التي يمكن تطبيقها لتقييم استجابات الخلايا التائية الناجمة عن الفيروس لقاح جدري المؤتلف.
الخلايا التائية تلعب دورا محوريا في الاستجابة المناعية التكيفية، وغالبا ما تستهدف التلاعب في العلاج المناعي. CD4 + T المستجيب الخلايا الرد على مستضد عن طريق إفراز السيتوكينات الخارجية التي تنظم جوانب كثيرة من الحصانة ويمكن أن يساعد أيضا الخلايا البائية مباشرة لتصنيع الأجسام المضادة. خلايا CD8 + T السامة للخلايا (CTLs) يمكن أن تستجيب أيضا لمستضد عن طريق إفراز السيتوكينات الخارجية وكذلك تلعب دورا مركزيا في قتل الخلايا مباشرة تعبر عن مستضد الأجنبية. التفاعل الأساسي الذي يبدأ هذه الوظائف المستجيب الخلايا التائية ينطوي على التفاعل بين الخلايا مستقبلات T (TCR) مع الببتيدات الأجنبية المعروضة على جزيئات MHC على سطح الخلايا. خلايا CD4 + T تعترف الببتيدات المعروضة على جزيئات MHC من الدرجة الثانية على مستضد تقديم الخلايا وخلايا CD8 + T تعترف الببتيدات المعروضة على جزيئات MHC-I الطبقة التي عادة ما يتم عرضها على الخلايا المصابة ميكروب.
من أجللتقييم الدور الذي تلعبه الخلايا التائية في الاستجابة المناعية، فمن الضروري أن ظائف المستجيب التي يتم قياسها من خلال تقنيات موثوقة وحساسة. وتشمل الطرق الشائعة لتقييم استجابة الخلايا T؛ MHC class-I/II/peptide tetramer التفاعل؛ إنتاج السيتوكينات التي كتبها ELISPOT والخلايا تلطيخ خلوى؛ وقتل القدرات بنسبة 51 المقايسات الكروم، الإصدار. هذه المقايسات، ومع ذلك، وعادة ما يتم تنفيذ فيفو السابقين مع التحفيز في المختبر، أو تقديم رؤية محدودة في وظيفة خلايا تي. من الناحية المثالية، عند قياس استجابات الخلايا التائية أنه سيكون من المفيد لتقييم لهم في الموقع، في الجسم الحي عند حدوثها، مع عدم وجود التلاعب من الخلايا T وذلك لتجنب التغيرات في المعايير الفنية التي قد تحدث من خلال التحفيز في المختبر. وتستند بعض من الأكثر شيوعا في الجسم الحي الخلايا التائية المقايسات الفنية على قياس القتل CTL بوساطة الخلايا المستهدفة نابض مع الطبقة MHC الببتيدات أنا ملزم بأن يتم تعداد في الجسم الحيعبر الكشف من خلال وضع العلامات الفلورية مع الأصباغ الحيوية مثل CFSE. في حين أن هذه الأنواع من المقايسات يمكن رصد مقتل CTL بوساطة من الأهداف عندما يحدث في الجسم الحي، وكان لديهم في السابق قدرة محدودة نسبيا لتقييم مقتل أهداف متعددة تقديم تركيزات مختلفة وأنواع مختلفة من الحواتم الببتيد، وهو مطلوب للسماح المعلمات النوعية مثل الطمع وظيفية وحاتمة البديل عبر التفاعل ليتم تقييمها. هذه المقايسات أيضا لا توفر أي معلومات عن CD4 + T الخلية بوساطة الاستجابات.
للتغلب على العديد من القيود مع الأساليب الحالية المستخدمة لتقييم استجابات الخلايا التائية، وقد وضعنا مؤخرا مقايسة متعددة استنادا صفائف الفلورسنت الهدف (اتفاقيات التجارة الحرة)، والذي يسمح للرصد استجابات الخلايا T ضد> 250 الخلايا المستهدفة في وقت واحد في حيوان واحد من قبل التدفق الخلوي 1، 2. وتتألف اتفاقيات التجارة الحرة من الخلايا الليمفاوية المسمى مع بغازيتركيزات األطراف ومزيج من الأصباغ الحيوية مثل CFSE، CTV وثيقة البرنامج القطري السماح> 250 خلية من مجموعات مضان فريدة لتكون ولدت. لأن هذه الخلايا لا تزال قابلة للحياة وتعمل بكامل طاقتها، ويمكن حقنها في الحيوانات للسماح رصد تفاعلها مع الخلايا التائية المستجيب في الجسم الحي 3. على سبيل المثال، مجموعات الخلايا اتفاقية التجارة الحرة يمكن نابض مع MHC-I-الببتيدات ملزمة الطبقة للسماح تقييم مستضد محددة CTL بوساطة قتل الخلايا المستهدفة 1. بالإضافة إلى ذلك، ومجموعات الخلايا اتفاقية التجارة الحرة يمكن أيضا أن يكون نابض مع الببتيدات MHC الدرجة الثانية ملزمة، مما يتيح تقييم مستضد محددة الخلايا التائية المساعدة (T H) النشاط عن طريق تقييم تفعيل (عن طريق تقييم علامات تفعيل مثل CD69، CD44 و / أو CD62L) من خلايا B ضمن اتفاقية التجارة الحرة التي تحمل الببتيد وما شابه ذلك 2. منذ ويمكن الكشف عن أكثر من 250 أهداف في وقت واحد، فمن الممكن لقياس CTL وT H الاستجابات ضد العديد من مجموعات الخلايا المستهدفة نابض مع nالببتيدات umerous بتركيزات مختلفة وإدراج العديد من مكررات. وبالتالي يوفر الفحص FTA مستوى غير مسبوق من T تقييم استجابة المستجيب خلية في الجسم الحي.
نحن هنا تصف بالتفصيل بناء منطقة التجارة الحرة وإظهار الكيفية التي يمكن تطبيقها على تقييم استجابات الخلايا T في الجسم الحي. يصف الإجراء بناء منطقة تجارة حرة تتكون من 252 مجموعات الخلايا ملحوظ من خلال استخدام ثلاثة الأصباغ الحيوية، تتألف من 6 تكرارات من 42 مجموعات الخلايا نابض مع الطبقة MHC-I والببتيدات الثاني ملزم. وضع العلامات من 42 مجموعات الخلايا يحدث في 10 مل المخروطية القاع أنابيب وأنها مفيدة لوضع هذه في رف أنبوب كما هو مبين في الجدول رقم 1. يمكن تعديل هذه الطريقة لأعداد أقل من كتل ملحوظ كما هو مطلوب عن طريق تقليل كمية من وضع العلامات كل صبغة يؤديها 1.
نسلط الضوء على فائدة الفحص من خلال إظهار كيف يمكن قياس رد ووفاق الناتجة عن التطعيم للفيروسات جدري المؤتلف ضد الحواتم متعددة في لفيف صغير من الفئران. هذا يبين كيف يمكن استخدام مقايسة اتفاقية التجارة الحرة لقياس الاستجابات التراكمية والطمع وظيفية من خلال، على التوالي، واستخدام المساحة تحت منحنى (AUC) تقييم وقياس تركيز الببتيد الفعالة اللازمة لتوليد استجابات القصوى نصف (EC 50).
الاستفادة من اتفاقية التجارة الحرة القائمة على المقايسات هو أنها تسمح للتمييز من> 250 السكان الخلية المستهدفة قابلة للحياة وظيفية بالكامل من حيوان مضيف واحد بواسطة التدفق الخلوي. هذا يوفر مستوى من التعقيد لفي الجسم الحي تتدفق المقايسات مقرها الخلوي الذي لم يكن…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل عن طريق منح المشروع # 1010395 (بكريل وCP) و # 525431 (CR)، وبرنامج المنح # 455395 (CP) من المجلس الوطني للبحوث الصحية والطبية في أستراليا، وهو المركز الأسترالي للالتهاب الكبد وفيروس نقص المناعة البشرية الفيروسات EOI 2012 منحة (CR وRJJ) ومنحة من مؤسسة غوردون وجريتل قسم مشتركي DSL (بكريل وCR). نود أن نشكر Harpreet فوهرا ومايكل Devoy لصيانتها ممتازة من المختبر JCSMR نظام مراقبة الأصول الميدانية، ومرفق الاسترالية مؤسسة أبحاث السرطان الجزيئية البيولوجية للموارد، JCSMR، انو، لتخليق الببتيد، والدكتور ديفيد بويل، معامل CSIRO للصحة الحيوانية، جيلونج، أستراليا لتوفير الوالد الأسهم قاح فيروس نقص المناعة البشرية.
RPMI | Sigma | R8758 | |
Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
CTV | Invitrogen | C34557 | |
CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
EQUIPMENT: | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
Vortex | Scientific Industries Inc | ||
Centrifuge | Eppendorf | ||
Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |