Использование флуоресцентных целевых массивов для оценки Т-клеточные ответы<em> В естественных условиях</em
Summary
Способность контролировать Т-клеточные реакции в деталях в естественных условиях имеет важное значение для развития нашего понимания иммунного ответа. Здесь мы опишем использование люминесцентных целевых массивов (ССТ) в в естественных условиях Т-клеток анализа, который оценивает> 250 параметров одновременно с помощью проточной цитометрии.
Abstract
Способность контролировать Т-клеточные реакции в естественных условиях имеет важное значение для развития нашего понимания иммунного ответа и разработке иммунотерапии. Здесь мы опишем использование люминесцентные целевого массива технологии (FTA), которая использует жизненные красители, такие как карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловым эфиром (CFSE), фиолетовый лазерных возбудимых красителей (CellTrace Фиолетовый: CTV) и красный лазер возбудимых красителей (пролиферации клеток Краска eFluor 670: CPD ) в комбинаторно этикеток лимфоциты мыши в> 250 различимых кластеров люминесцентных клеток. Сотовые кластеры внутри этих ССТ может быть импульсным с главного комплекса гистосовместимости (МНС) связывающие пептиды класса I и МНС класса-II и тем самым выступать в качестве клеток-мишеней для CD8 + и CD4 + Т-клеток, соответственно. Эти FTA клетки остаются жизнеспособными и полностью функциональным, и, следовательно, могут быть введены мышам с целью оценки CD8 + Т-клеточно-опосредованного убийства ССТ клеток-мишеней и CD4 + Т-клеток-медитировал Хельр FTA B клетки-мишени клеток в реальном времени в естественных условиях с помощью проточной цитометрии. С> 250 клеток-мишеней может быть оценена сразу, техника позволяет контролировать Т-клеток ответов против нескольких антигенных эпитопов в нескольких концентрациях и в нескольких повторах. Таким образом, способ может измерять Т-клеточные реакции как на количественном (например, совокупный величины ответа) и качественными (например, функциональной. Авидности и эпитоп-перекрестной реактивности в ответ) уровне. В данном случае мы описываем, как эти ССТ построены и дают пример того, как они могут быть применены для оценки Т-клеточные реакции, вызванные рекомбинантной вакцины вируса оспы.
Introduction
Т-клетки играют центральную роль в адаптивного иммунного ответа и часто становятся мишенью для манипуляций в иммунотерапии. CD4 + эффекторные Т клетки реагируют на чужеродный антиген по секреции цитокинов, которые регулируют многие аспекты иммунитета, а также может напрямую помочь В-клеток для производства антител. CD8 + цитотоксические Т-клетки (CTL) также может реагировать на чужеродный антиген по секреции цитокинов, а также играет центральную роль в непосредственно убивает клетки выражая чужеродный антиген. Фундаментальное взаимодействие, которое инициирует эти функции эффекторных Т-клеток включает взаимодействие Т-клеточного рецептора (TCR) с иностранными пептидов, отображаемых на молекул МНС на поверхности клеток. CD4 + Т-клетки распознают пептиды, представленные на молекул МНС класса-II на антиген-представляющих клеток и CD8 + Т-клетки распознают пептиды, представленные на молекул МНС класса-I, которые обычно отображаются на микробных клеток, инфицированных.
В порядкеоценить роль Т-клетки играют в иммунного ответа, важно, что их эффекторные функции измеряются надежных и чувствительных методов. Общие методы оценки отклика клеток T включают в себя: МНС class-I/II/peptide тетрамером реактивность; продукция цитокинов по ELISPOT и внутриклеточного окрашивания цитокинов; и убивая мощности на 51 Cr-релиз анализов. Эти анализы, однако, как правило, выполняются экс виво со стимуляцией в пробирке, или обеспечивают ограниченное понимание функции Т-клеток. В идеале, при измерении Т-клеточные ответы, было бы полезно, чтобы оценить их на месте, в естественных условиях, как они происходят, без манипулирования Т-клеток с тем, чтобы избежать изменений в функциональных параметров, которые могут возникнуть через стимуляцию в пробирке. Некоторые из наиболее часто используемых в естественных Т-клеток функциональных анализов, основанный на измерении CTL, опосредованного умерщвление клетки-мишени импульсных с МНС класса I-связывающих пептидов, которые перечислены в естественных условияхчерез их обнаружения через флуоресцентного мечения витальных красителей, таких как CFSE. Хотя эти типы анализов может контролировать CTL, опосредованного убийство целей, когда они происходят в живом организме, они ранее были сравнительно ограниченные возможности для оценки убийства нескольких целей, представляющих различные концентрации и различных типов пептидных эпитопов, который необходим, чтобы позволить качественные параметры, такие как функциональные алчность и Эпитоп вариант перекрестной реактивности в оценке. Эти анализы также не дает никакой информации о CD4 + Т-клеток опосредованных реакций.
Чтобы преодолеть многие из ограничений с нынешних методов, используемых для оценки Т-клеточные реакции, мы недавно разработали многозальный анализа на основе флуоресцентных целевых массивов (ССТ), которая позволяет осуществлять мониторинг Т-клеточного ответа против> 250 клеток-мишеней одновременно в одном животного проточной цитометрии 1, 2. ССТ состоят из лимфоцитов, меченных нескольконцентрации Eral и комбинации витальных красителей, как CFSE, CTV и ДСП, позволяющих> 250 клеток кластеры уникальной флуоресценции, которые будут созданы. Так как эти клетки остаются жизнеспособными и полностью функциональным, они могут быть введены в животных, чтобы обеспечить контроль за их взаимодействие с эффекторных Т-клетках в естественных условиях 3. Например, клеточные кластеры FTA может быть импульсным с МНС класса пептидов-I-связывания, чтобы позволить оценку антиген-специфических ЦТЛ, опосредованной гибели клеток-мишеней 1. Кроме того, кластеры клеток FTA также может быть импульсным с МНС класса-II-связывающих пептидов, позволяя оценка антигена специфические Т-хелперных клеток (T H) путем оценки активности активацию (по оценке маркеров активации CD69, таких как CD44, и / или CD62L) В-клеток в пределах ЗСТ несущих родственный пептид 2. Поскольку более 250 мишени могут быть обнаружены одновременно, можно измерить ЦТЛ и Т H ответы против многих кластеров клеток-мишеней с п импульсныхumerous пептиды в различных концентрациях и включение многих повторов. FTA анализ, следовательно, обеспечивает беспрецедентный уровень Т-клеточного эффекторной оценки реакции в естественных условиях.
Здесь мы опишем подробно строительство ЗСТ и показать, как они могут быть применены к оценке Т-клеточные реакции в естественных условиях. Процедура описывает конструкцию ЗСТ, состоящей из 252 различимых кластеров клеток за счет использования трех жизненно важных красителей, состоящих из 6 повторами 42 кластеров клеток импульсных с МНС класса-I и II-связывающих пептидов. Маркировка 42 кластеров клеток происходит в 10 мл коническую дном трубки и это полезно, чтобы заложить эти в стойке трубки, как показано в таблице 1. Этот метод может быть отрегулирован для меньшим числом различаемых кластеров в соответствии с требованиями уменьшения количества маркировки каждого красителя производится 1.
Мы подчеркиваем полезность анализа, показывая, как он может измерять отвэс генерируемые рекомбинантного оспа-вирусной вакцинации против нескольких эпитопов в небольшой группе мышей. Это показывает, насколько этот анализ FTA может быть использован для измерения кумулятивные ответы и функциональный алчность через, соответственно, использование площади под кривой (AUC) оценки и измерения эффективной концентрации пептида, необходимого для генерации половиной ответов максимальные (EC 50).
Protocol
Representative Results
Discussion
Преимущество анализов РИФ-основе, что они позволяют дискриминацию> 250 населения жизнеспособным и полностью функциональный клеток-мишеней с одного животного-хозяина с помощью проточной цитометрии. Это обеспечивает уровень сложности для естественных условиях проточной цитомет?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана проекта грантов # 1010395 (BQ и СР) и # 525431 (CR), а также грантовой программы # 455395 (СР) из Национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии, австралийский Центра гепатита и ВИЧ вирусологии ВЗ 2012 грант (CR и RJJ) и грант от Гордона и Гретель Волопаса Foundation (BQ и CR). Мы хотели бы поблагодарить Harpreet Вохра и Майкл Devoy за отличную поддержания лаборатории JCSMR FACS, Фонд Австралии онкологический научный фонд Биомолекулярная ресурсов, JCSMR, АНУ, для синтеза пептидов, и д-р Дэвид Бойл, CSIRO животных лаборатории здоровья, Джилонг, Австралия для обеспечения запасов вакцин против ВИЧ родительские.
Materials
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| Fetal calf serum | Serana | FCS-500 | |
| CTV | Invitrogen | C34557 | |
| CFDA, SE | Invitrogen | C1157 | |
| CPD | eBioscience | 65-0840-90 | |
| anti-B220 PerCp-Cy5.5 | eBioscience | 110730 | |
| anti-CD69 brilliant violet 605 | Biolegend | 104529 | |
| PKH-26 | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| EQUIPMENT: | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Vortex | Scientific Industries Inc | ||
| Centrifuge | Eppendorf | ||
| Flow cytometer (Fortessa or equivalent with blue, red and violet laser source) | BD Bioscience |
References
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array killing assay: A multiplex cytotoxic T-cell assay to measure detailed T-cell antigen specificity and avidity in vivo. Cytometry A. 81, 679-690 (2012).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. Fluorescent target array T helper assay: a multiplex flow cytometry assay to measure antigen-specific CD4+ T cell-mediated B cell help in vivo. J Immunol Methods. 387, 181-190 (2013).
- Quah, B. J., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J Immunol Methods. 379, 1-14 (2012).
- Mata, M., Paterson, Y. Th1 T cell responses to HIV-1 Gag protein delivered by a Listeria monocytogenes vaccine are similar to those induced by endogenous listerial antigens. J Immunol. 163, 1449-1456 (1999).
- Earl, P. L., et al. Design and evaluation of multi-gene, multi-clade HIV-1 MVA vaccines. Vaccine. 27, 5885-5895 (2009).
- Wild, J., et al. Preclinical evaluation of the immunogenicity of C-type HIV-1-based DNA and NYVAC vaccines in the Balb/C mouse model. Viral Immunol. 22, 309-319 (2009).
- Takeshita, T., et al. Molecular analysis of the same HIV peptide functionally binding to both a class I and a class II MHC molecule. J Immunol. 154, 1973-1986 (1995).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3, 361-368 (2006).
- Gilbert, D. F., Wilson, J. C., Nink, V., Lynch, J. W., Osborne, G. W. Multiplexed labeling of viable cells for high-throughput analysis of glycine receptor function using flow cytometry. Cytometry A. 75, 440-449 (2009).
- Quah, B. J., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J Vis Exp. , (2010).
- Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. , (2010).
- Hermans, I. F., et al. The VITAL assay: a versatile fluorometric technique for assessing CTL- and NKT-mediated cytotoxicity against multiple targets in vitro and in vivo. J Immunol Methods. 285, 25-40 (2004).
- Busch, D. H., Pamer, E. G. T cell affinity maturation by selective expansion during infection. J Exp Med. 189, 701-710 (1999).
- Savage, P. A., Boniface, J. J., Davis, M. M. A kinetic basis for T cell receptor repertoire selection during an immune response. Immunity. 10, 485-492 (1999).
- Wang, X. L., Altman, J. D. Caveats in the design of MHC class I tetramer/antigen-specific T lymphocytes dissociation assays. J Immunol Methods. 280, 25-35 (2003).
- von Essen, M. R., Kongsbak, M., Geisler, C. Mechanisms behind functional avidity maturation in T cells. Clin Dev Immunol. , (2012).
- Prussin, C., Metcalfe, D. D. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J Immunol Methods. 188, 117-128 (1995).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods. 65, 109-121 (1983).
- Klinman, D. ELISPOT assay to detect cytokine-secreting murine and human cells. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Yerly, D., et al. Increased cytotoxic T-lymphocyte epitope variant cross-recognition and functional avidity are associated with hepatitis C virus clearance. J Virol. 82, 3147-3153 (2008).
