Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

Summary

A aplicação de matriz assistida por laser de dessorção / ionização por tempo de voo (MALDI-TOF), espectrometria de massa (MS) directamente ao caldo de cultura do sangue acelera a identificação de bactérias. O método apresentado é um método rápido e fiável para a identificação de bactérias Gram-negativas directamente do caldo de cultura do sangue.

Abstract

Um papel importante do laboratório de microbiologia clínica é proporcionar a rápida identificação de bactérias que causam infecção na corrente sanguínea. Identificação tradicional exige a sub-cultura do sinalizou caldo de cultura de sangue com a identificação disponível somente depois colônias em agar sólido amadureceram. MALDI-TOF MS é um método fiável, rápido para a identificação da maioria das bactérias clinicamente relevantes, quando aplicado para colónias em meios sólidos. A aplicação de MALDI-TOF MS diretamente ao caldo de cultura de sangue é uma abordagem atraente, pois tem potencial para acelerar a identificação de espécies de bactérias e melhorar a gestão clínica. No entanto, um problema importante para superar é a remoção de pré-análise de interferentes resinas, proteínas e hemoglobina contidos em amostras de cultura do sangue, que, se não for removido, interferem com os espectros de MS e pode resultar em pontuações suficientes ou baixos de identificação de discriminação. Além disso, é necessário concentrar a bactériaia para desenvolver espectros de qualidade suficiente. O método apresentado descreve a concentração, purificação e extração de bactérias Gram negativas que permitem a identificação precoce de bactérias a partir de um caldo de cultura de sangue sinalizado.

Introduction

Os pacientes com infecção de corrente sanguínea (BSI), devido a bactérias continuam a ter alta taxa de mortalidade intra-hospitalar, que vão 6-48% ^1. A entrega de antibiótico empírico adequado promove a sobrevivência e no subgrupo de pacientes com sepse grave, a cada hora de atraso para a terapêutica adequada se relaciona à diminuição da sobrevivência ^{de 2,3.} Assim, um objectivo-chave do laboratório clínico é detectar rapidamente, identificar e comunicar a presença de bactérias em hemoculturas para informar as decisões clínicas. Tem sido demonstrado que o laboratório microbiológico tem a maior influência sobre a terapia antimicrobiana no momento de relatar a coloração de Gram e ⁴ recentemente, um estudo de observação demonstraram que o tempo de dessorção a laser assistida por matriz / ionização de voo de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS) realizado diretamente em caldos de cultura de sangue influenciar a prescrição em mais de um terço da BSI causada por bactérias Gram negativas ^5.

<p class="Jove_content"> O desenvolvimento comercial de MALDI-TOF MS levou a uma ferramenta de laboratório eficaz para a identificação de microrganismos ^6,7. A tecnologia está agora bem estabelecida e tem sido integrado em muitos laboratórios para a identificação rápida e precisa dos microorganismos isolados em ^6,8 meios sólidos. A aplicação direta de MALDI-TOF MS para hemocultura (BC) caldo que sinalizaram "positivo" para microorganismos apela para os clínicos e gestores de laboratório por causa do potencial para obter a identificação precoce de microorganismos com baixo custo.

A utilidade clínica da aplicação directa de MALDI-TOF MS para caldo de cultura de sangue tem sido limitada pela ampla gama de sensibilidades observadas quando comparado com os métodos baseados cultura fenotípica padrão de identificação, com relatos de uma identificação bem sucedida de bactérias Gram-negativas variam 47-98,9 ^9-11%. A variação na sensibilidade provávelrelaciona-se com a composição BC caldo, a concentração bacteriana inicial, a variação dos métodos de preparação da amostra, bem como a gama de organismos gram-negativos encontrados em populações de estudo ^9. Em comparação com estes outros protocolos publicados pelo método aqui apresentado evita a utilização de etanol, cloreto de amónio ou (não-matriz) acetonitrilo adicional. Como resultado, o pellet bacteriano permanecerá viável (até o ponto de extração de proteínas) permitindo potenciais métodos de análise fenotípica de susceptibilidade para ser aplicado diretamente a estes organismos em caldo. Além disso, o método apresentado tem sido mostrado a ser barato, fiável e rápida, com a identificação de bactérias disponíveis dentro de 25 min dos resultados de cultura de sangue Gram mancha, com o mínimo 'mãos no tempo ^12.

Este método é um protocolo simples em casa spin-lise utilizando extração ácido fórmico aplicados diretamente para caldos de cultura de sangue positivos para identificar Gram negativo bacteria com tecnologia de MALDI-TOF MS.

Protocol

1. Sangue Cultura Caldos Bandeira como "positiva" Retire a garrafa de hemocultura sinalizou a partir do contínuo monitoramento do gabinete de incubação e coloque-o em uma cabine de segurança biológica. Nota: Os frascos podem conter microorganismos perigosos e precauções universais precisam ser seguidas. Devido ao risco de aerossóis infecciosos em amostragem, todos os procedimentos de amostragem deve ser realizada em um Biossegurança Classe II câmara de fluxo laminar. <p cla…

Representative Results

A MALDI-TOF MS espectros gerados são comparados com a base de dados de espectros de referência integrada. A pontuação logarítmica é atribuído pela confiança do jogo entre o isolado de teste eo banco de dados de referência isola, com a recomendação de uma pontuação ≥ 1.7 necessário para provável identificação ao nível de gêneros (Figura 1) e ≥ 2.0 para provável identificação de espécies (Figura 2). Comunicar ao nível de espécie, quando a pontuação ≥ 1,7 e…

Discussion

É importante quando se aplica MALDI-TOF MS para caldo de cultura de sangue que as etapas de pós centrifugação são realizados com o cuidado suficiente para não remixar os componentes separados. É particularmente importante para remover os constituintes de culturas de sangue e as proteínas celulares humanas, incluindo a hemoglobina, o que pode produzir picos interferindo com o espectro de MALDI-TOF.

Embora MS fabrica recomendo cortar de pontuação ≥ 2,0 para as espécies e ≥ 1,7 p…

Materials

BACTEC Plus Aerobic/F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442192
BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442265
BACTEC Peds Plus Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442194
Vacutainer – Blood transfer device	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	364880	Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury
Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	367954	Serum separating tube
Syringe 10 mL	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	302143
Transfer pipette	Samco, USA	222-20S
Transfer pipette (fine tipped)	Samco, USA	232-20S
Microcentrifuge tube (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030.120.094
Sterile water (DNAse and RNAse free)	Life Technologies, Carlsbad, California, USA	10977-015
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	F0507
Matrix solution	Bruker Daltonics, Bremen Germany	285074	10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid
Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS	Bruker Daltonics, Bremen Germany		Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software