في المختبر البنكرياس توالد من تفرقوا الجنينية الماوس أسلاف

Summary

طريقة ثقافة ثلاثية الأبعاد الموصوفة في هذا البروتوكول يلخص التنمية البنكرياس من الأسلاف المتفرقة الجنينية الماوس البنكرياس، بما في ذلك توسعها الكبير، والتمايز والتشكل في هيئة متفرعة. هذا الأسلوب هو قابل للتصوير، والتدخل الوظيفية والتلاعب في مكانه.

Abstract

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells ¹. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development ^2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.

We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.

We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.

Introduction

يوفر الجهاز الثقافة نموذجا مفيدا أن يسد الفجوات بين المجمع ولكن ذات أهمية كبيرة في التحقيقات المجراة والمحاكاة مريحة ولكن التقريبية للنماذج خط الخلية. في حالة البنكرياس، وليس هناك خط الخلية يعادل تماما لالأسلاف البنكرياس على الرغم من أن هناك يتم تحويل خطوط الخلايا محاكاة خلايا الغدد الصماء وإفرازات. لا يمكن تربيتها الكبار البنكرياس كله؛ يمكن الحفاظ على الجزر المعزولة الغدد الصماء لبضعة أسابيع دون تكاثر الخلايا ويمكن أن تظل شرائح الأنسجة في المختبر لبضع ساعات ^5. وقد الثقافة البنكرياس الجنينية المستخدمة على نطاق واسع ليس فقط لدراسة تطورها، ولكن أيضا للتحقيق في الظهارة الوسيطة التفاعلات ^4،6،7، لصورة يعالج ⁸ أو التدخل كيميائيا معهم ^9. وتستخدم طريقتين ثقافة الجهاز أساسا: الأول يتمثل في زراعة براعم البنكرياس على فبرونيكتين المغلفة لوحات ^2، وهو محول،nient لأغراض التصوير؛ الخيار الثاني هو الثقافة الأجهزة على مرشحات في واجهة الهواء السائل ^3،4 الذي يحافظ على أفضل التشكل. على الرغم من المفيد جدا، وهذه الأساليب تؤدي إلى درجة معينة من تسطيح؛ توسيع الأسلاف محدودة جدا بالمقارنة مع التطور الطبيعي والسكان بدءا معقد يضم جميع أنواع خلايا البنكرياس وخلايا اللحمة المتوسطة.

القدرة على الثقافة، وتوسيع الخلايا الأولية فرقت هو قيمة لدراسة علاقات النسب وكشف الخصائص الذاتية من أنواع الخلايا المعزولة ^10. سوغيياما وآخرون ¹¹ يمكن الحفاظ على الأسلاف البنكرياس والغدد الصماء الأسلاف التي احتفظت بعض الشخصيات الفنية لمدة 3-5 أيام في الثقافة على طبقات المغذية. Pancreatospheres، أقرب إلى neurospheres ¹² و ¹³ mammospheres، تم توسيع من الجزر الكبار وخلايا الأقنية على الرغم من أن طبيعة الأسلاف / الخلايا الجذعيةالتي تولد هذه المجالات ليست واضحة. بالإضافة إلى ذلك، في تناقض مع التنمية الفسيولوجية، تضمن pancreatospheres بعض الخلايا العصبية ^14،15. كما أنتجت مؤخرا المجالات من الأسلاف البنكرياس الجنينية ^16،17 وتجديد ¹⁸ بنكرياسات جيدة مع التوسع السلف والتمايز لاحقة لكنها فشلت في ألخص التشكل.

3D نماذج من الخلايا المتفرقة وغالبا ما تعرف أن تنظيم الذاتي في الأجهزة المنمنمة ازدهرت مؤخرا ومحاكاة تطوير أو الكبار دوران أجهزة متعددة مثل الأمعاء ^{19،20، 21} المعدة، والكبد ^{22، 23} البروستاتا والقصبة الهوائية ^24. في بعض الحالات، وقد لخص التشكل التنموية والتمايز في 3D من خلايا ES، كما هو الحال بالنسبة للأكواب البصرية ^{25، 26} الأمعاء أو الدماغ ^27.

هنا، ونحن قصرcribe طريقة لتوسيع فصلها الأسلاف البنكرياس متعددة القدرات في سقالة 3D Matrigel حيث يمكنهم تمييز وتنظيم الذات.

Protocol

ويهدف هذا البروتوكول لتنمو organoids البنكرياس المستمدة من الفئران E10.5 فصل الخلايا الظهارية البنكرياس. البروتوكول يتطلب موافقة أخلاقية لإجراء التجارب على الحيوانات. 1. تشريح الظهرية البنكرياس بر?…

Representative Results

E10.5 الظهرية الأسلاف البنكرياس فصلها والمصنفة في 3D Matrigel ألخص التنمية البنكرياس. الأسلاف يمكن اتباعها بسهولة أكثر مع صحفيين الفلورسنت. في حالتنا استخدمنا الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن بروتين GFP النووية التي تسيطر عليها Pdx1 المروج (Pdx1-Ngn3-ER TM-nGFP) (فيلم …

Discussion

الإنتاج على نطاق واسع من خلايا بيتا وظيفية في المختبر لا تزال غير فعالة ^1. في هذا السياق الصعب، قد تساعد الدراسات البيولوجيا التطورية فك رموز الإشارات الدقيقة التي مطلوبة من أجل تمايز الخلايا بيتا وظيفية. هذا البروتوكول يسمح للصيانة وتوسعة والتفريق بين ال?…

Materials

Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
KnockOut Serum replacement (supplement)	Gibco	10828-028	Stock keept at -20°C
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	3148-25ML	Stock keept at 4°C
Phorbol Myristate Acetate (PMA)	Calbiotech	524400-1MG	Stock keept at -20°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
EGF	Sigma Aldrich	E9644-2MG	Stock keept at -80°C
Recombinant Human R-spondin 1	R&D	4645-RS-025/CF	Stock keept at -80°C
- or -
Recombinant Mouse R-spondin 1	R&D	3474-RS-050	Stock keept at -80°C
Recombinant Human FGF1 (aFGF)	R&D	232-FA-025	Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production
Heparin (Liquemin)	Drossapharm		Stock keept at 4°C
Recombinant Human FGF10	R&D	345-FG-025	Stock keept at -80°C
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15070-063	Stock keept at -20°C
B27 x50 (supplement)	Gibco	17504-044	Stock keept at -20°C
Recombinant Human FGF2 (bFGF)	R&D	233-FB-025	Stock keept at -80°C
Y-27632 (ROCK inhibitor)	Sigma Aldrich	ab120129	Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems
DMEM/F-12	Gibco	21331-020
Matrigel	Corning	356231	Stock keept at -20°C
Trypsin 0.05%	Gibco	25300-054	Stock keept at 4°C
RNAlater – RNA stabilizing reagent	Qiagen	76104	Store at room temperature
Dispase	Sigma Aldrich	D4818-2MG	Stock keept at -20°C
BSA for reconstitution	Milipore	81-068	For reconstituition of cytokines  – Stock keept at -20°C
Fetal calf serum (FCS)	Gibco	16141079	Stock keept at -20°C
60 well MicroWell trays	Sigma Aldrich	M0815-100EA
4-well plates	Thermo Scientific	176740
95-well plates F bottom	Greiner Bio	6555180
Glas bottom plates	Ibidi	81158
Disposal micropittes	Blaubrand	708745