小鼠皮肤平铺成像及其在毛囊排列模式与感觉轴突形态分析中的应用

摘要

哺乳动物的皮肤包含多种结构——如毛囊和神经末梢——这些结构具有独特的空间分布模式。将皮肤作为平铺标本进行分析，可利用该组织的二维几何特性，获得皮肤结构的全层高分辨率图像。

摘要

皮肤是一种高度异质性的组织。皮肤内结构包括毛囊、立毛肌、表皮特化结构（如默克尔细胞簇）、皮脂腺、神经和神经末梢以及毛细血管。这些结构的空间排列在微观尺度上受到严密调控——例如单个毛囊内不同细胞类型的有序排列——同时也在宏观尺度上表现出精确性——例如皮肤局部区域内成千上万个毛囊近乎一致的取向。由于皮肤器官具有二维几何特性，因此无需物理切片即可实现对这些结构的可视化观察。在本实验方案中，我们展示小鼠皮肤可被完整解剖、固定、通透化、染色并作为完整的二维平面样本（即平铺标本）进行透明化处理。该方案通过光学切片与三维重建，可轻松实现对大面积皮肤全层厚度内各种结构的整体可视化。这些结构的图像还可与它们相对于身体轴线的位置和方向信息进行整合。

引言

皮肤是人体最大的器官之一，在躯体感觉、绝缘/体温调节以及免疫防御方面具有重要功能¹。由于皮肤作为一个生物系统具有根本重要性，并且与皮肤病学密切相关，因此理解其发育和功能的分子与细胞基础长期以来备受关注。哺乳动物的皮肤包含多种多细胞结构，包括分层排列的角质形成细胞、真皮结缔组织、多种类型的毛囊、皮脂腺、竖毛肌、血管，以及至少十余种不同类型的传入（感觉）和传出神经纤维（图1）。身体不同区域具有特征性不同的皮肤类型。在大多数哺乳动物中，几乎整个体表都被密集分布毛囊的皮肤所覆盖。[人类和裸鼹鼠是这一模式的例外。] 手掌和足底表面无毛发，但具有特化的表皮纹路（皮纹）、外分泌腺以及感觉神经末梢。控制毛囊内细胞生长、分化和空间排列的细胞与分子事件尤其受到关注，因为每个毛囊都微型地展现出器官发生过程中的许多核心特征²。这些特征包括干细胞及其微环境的存在、精确调控的细胞迁移，以及由胚胎起源不同的组分组装成多细胞结构的过程。

本文介绍了将小鼠皮肤作为完整的二维薄片（称为“整体装片”或“平展装片”制备）进行解剖、固定、标记和成像的方法。由于小鼠皮肤相对较薄，可利用常规共聚焦显微镜对展平皮肤的全层进行成像。这种平展装片的哺乳动物皮肤成像方法在技术上具有优势，因为它避免了物理切片的需要，从而能够完全通过光学切片重建结构。由于几乎整个皮肤都被作为一个单一整体进行处理，平展装片法还能在保留相对于身体轴的位置和方向信息的同时，实现....

方案

本研究严格遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》中的建议进行。所有动物操作均按照约翰斯·霍普金斯医学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案 MO11M29 执行。有关安乐死的批准方法，请参考您所在机构的动物护理与使用委员会指南。处理醛类固定剂或有机溶剂时，应佩戴手套、实验服和护目镜。

1. 材料准备

1. 浇注 Sylgard 平板
   1. 按照制造商的说明，将固化剂与基础剂混合，并用塑料棒搅拌。
   2. 每个直径为 10 cm 的组织培养皿中加入约 35 ml 液态 Sylgard。组织培养皿比标准细菌培养皿更深，可为昆虫针提供足够的垂直空间。
   3. 将培养皿置于室温下的水平表面上静置过夜。混合过程中产生的气泡将自行消失。
   4. 聚合完成后，将 Sylgard 平板在室温下保存。
      注意：Sylgard 平板可在室温下保存多年，并可多次重复使用，直至 Sylgard 从培养皿上脱落。
2. 溶液配制
   1. 苯甲酸苄酯与苄醇（BBBA）。将 2 体积的苯甲酸苄酯与 1 体积的苄醇混合。避光保存于带玻璃塞或聚四氟乙烯（Teflon）盖的玻璃瓶中。
      警告：使用过的 BBBA 应作为有机溶剂废物妥善处理。避免 BBBA 接触塑料材料。
   2. 磷酸盐缓冲液（PBS）。将 ....

结果

明场成像可用于观察皮肤平铺片中的皮肤感觉传入神经（图3A¹⁰）以及基于黑色素沉着的毛囊排列模式（图4）。共聚焦成像可用于界定以下结构的几何形态：（1） Merkel细胞簇，可通过抗角蛋白6抗体标记或AM染料摄取显示（图3I-L）；（2）立毛肌，可通过抗平滑肌肌动蛋白抗体标记显示（图3G,H）；（3）皮脂腺，可通过油红O染色显示（图3C-F）；（4）毛囊，可通过Krt17-GFP转基因表达或抗Krt17抗体染色显示⁴（图3E-G,K,L）。通过在图像中使用Adobe Photoshop或Illustrator对结构添加已知方向的矢量，可手动评估这些结构的方向和空间排列，并进一步量化所得的矢量群体。尽管该方法适用于数百个矢量规模的分析，但在大10倍或100倍的规模下将变得极为繁琐，难以实施。

讨论

掌握上述解剖方法仅需耐心、稳定的手法以及一些优质的解剖工具。背部皮肤解剖相对容易，但尾部和足部皮肤的解剖——尤其是在出生后早期阶段——更具挑战性。在较早的胚胎期（例如，E15之前），皮肤极易撕裂，难以完整剥离。幸运的是，对于许多关于小鼠皮肤结构生长与模式形成的研究而言，关键事件发生在出生后阶段，例如竖毛肌生长的研究即为一例¹⁹。

以平铺方式对皮肤深层进行成像具有挑战性，因为皮肤是一种折射率较高的组织。随着皮肤成熟，其结构层发生分化且厚度增加，这一挑战进一步加大。解决该问题的一种部分方法是将真皮与表皮分离，并将表皮作为独立结构进行分析（“表皮全层制片”）。该方法适用于观察毛囊及其相关结构，尤其适用于小鼠尾部皮肤。然而，从小鼠背部皮肤获取高质量的表皮全层制片较为困难，推测原因可能包括：（1）毛囊密度较高且深入真皮层；（2）间毛囊表皮较薄¹³。

根据我们的经验，BBBA 处理是一种非常有效的方法，可在无需分离表皮和真皮层的情况下使皮肤在光学上透明，同时保留免疫荧光信号。苯.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-溴-4-氯-吲哚磷酸盐（BCIP）	Roche	11383221001
AM1-43	Biotium	70024
AM4-65	Biotium	70039
苯甲醇	Sigma	402834
苯甲酸苄酯	Sigma	B-6630
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM700
Cy3-α-平滑肌肌动蛋白抗体	Sigma	C6198	1:400
细胞角蛋白-8	发育研究杂交瘤库	TROMA-I-c	1:500
解剖显微镜
解剖工具	精细科学工具公司		剪刀和镊子
电动剃须刀
Fluoromount G	EM Sciences	17984-25
福尔马林	Sigma	HT501320
玻璃培养皿	Pyrex		直径6 cm和10 cm
玻璃板	Amersham Biosciences	SE202P-10	10 cm × 8 cm × 1 mm
脱毛剂	Nair
水平旋转平台	Hoefer	PR250 Orbital shaker
昆虫针	Fine Science Tools	26002-20
氯胺酮/赛拉嗪	Sigma	K113
硝基蓝四氮唑（NBT）	Roche	11383213001
油红O	Sigma	O0625
多聚甲醛	Sigma	P6148
剃刀刀片	VWR	55411-055
二抗	Invitrogen		Alexa染料偶联
Sylgard-184	赛默飞世尔科技	NC9020938
组织培养塑料培养皿			直径10 cm
组织培养板			6孔和12孔