마우스의 피부와 모낭 패터닝 및 감각 축삭 형태학의 분석에의 응용의 평면 마운트 이미징
Summary
이러한 모낭과 신경 엔딩으로 – – 공간 조직의 독특한 패턴을 전시 포유류의 피부 구조의 다양한 배열을 포함합니다. 플랫 마운트로 피부를 분석하는 것은 피부 구조의 전체 두께의 고해상도 이미지를 생성하기 위해이 조직의 2 차원 적 형상을 이용한다.
Abstract
피부가 매우 이질적인 조직이다. 내 피부 구조는 모낭, arrector의 필리 근육 (예 : 메르켈 세포 클러스터 등) 표피 전문, 피지 분비, 신경 및 말초 신경과 모세 혈관이 (가) 있습니다. 이러한 구조의 공간적 배치는 밀접 미시적 제어된다 – 것과 같이, 예를 들면, 단일 모낭 내의 세포 유형의 질서 배열 – 및 거시적 규모 – 헤어 수천의 거의 동일한 배향으로 보이는 피부의 로컬 영역 내에서 난포. 물리적으로 피부를 구획하지 않고 이러한 구조를 떠올리 때문에이 기관의 2 차원 형상으로 할 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 마우스의 피부, 해부 고정 permeabilized, 염색, 및 손상되지 않은 두 개의 차원 개체, 평평한 산으로 명확히 할 수 있음을 보여준다. 이 프로토콜은 OPT에 의한 피부의 넓은 영역의 전체 두께를 통해 전체적으로 피부의 구조를 쉽게 시각화 할 수 있습니다iCal의 단면과 재건. 이러한 구조의 이미지는 몸 축에 위치 자세 관계에 관한 정보를 통합 할 수있다.
Introduction
피부는 somato – 감각, 절연 / 온도 조절, 및 면역 방어 1 중요한 기능과 몸에서 가장 큰 기관 중 하나입니다. 피부 개발 및 기능의 분자 및 세포 기초를 이해하기 때문에 생물학적 시스템과 피부과의 관련성 등 피부의 근본적인 중요성의 오랜 관심이었다. 포유류의 피부는 각질 세포의 층리, 피부 결합 조직, 모낭의 여러 종류, 피지선, arrector의 필리 근육, 혈관, 그리고 심성의 12 개 이상의 서로 다른 클래스 (감각)와 원심성 신경을 포함한 다세포 구조의 다양한 포함 섬유 (그림 1). 신체의 다른 영역은 피부의 특징적으로 다른 유형과 연결되어 있습니다. 대부분의 포유 동물에서 거의 몸 전체 표면을 조밀하게 머리 여포로 포장되어 피부에 덮여있다. [인간과 알몸 두더지 쥐 일까지 예외를 구성패턴입니다.] 머리는 전문 표피의 패턴 (dermatoglyphs), 외분비 샘, 감각 신경 말단에 연결된 손과 발,의 손바닥 표면에서 누락되었습니다. 성장, 분화, 그리고 모낭 내 세포의 공간 배열을 제어하는 세포 및 분자 사건은 기관 형성 (2)의 중앙의 여러 기능, 미니어처, 각각의 모낭의 전시와 같은 특별한 관심입니다. 이러한 기능은 줄기 세포의 존재와 줄기 세포 틈새 정확하게 안무 세포 마이그레이션 및 발생 학적으로 서로 다른 구성 요소에서 다세포 구조의 조립이 (가) 있습니다.
이 문서는 해부하는 방법을 설명, 고정, 라벨, 그리고 그대로 두 차원 시트와 같은 이미징 마우스의 피부는 "전체 산"또는 "평면 마운트"준비라고합니다. 마우스의 피부는 비교적 얇기 때문에, 평면화 스키의 전체 두께를 통해 화상에 가능한N 기존의 공 초점 현미경을 사용하여. 그것이함으로써 구조 광학 절편 전적으로 재구성 될 수 있도록, 물리 절편에 대한 필요성을 무시하므로 포유류 피부를 이미징 평면 실장 방식은 기술적으로 유리하다. 거의 전체 피부가 단일 객체로서 처리되기 때문에, 플랫 몸 축에 위치 자세 관계에 관한 정보를 유지하면서 접근 방법은 또한 신체 표면의 복수의 영역의 영상을 용이하게 탑재. 마지막으로, 피부 내 구조는 일반적으로 이와 관련 구조의 체류 대표자의 이미지의 수집을 용이하게 일정한 간격으로 반복되는 패턴으로 존재한다. 이러한 특성은 망막 신경 세포의 형태 (3)의 연구에 대해 유사한 이점을 즐긴다 중추 신경계의 이차원 부분에서 작동 신경 생물 학자에게 익숙하다.
여기에 설명 된 평면 마운트 방식은 특별한 utilit입니다피부의 2 차원 평면 내에서 상대적으로 큰 규모의 공간 조직을 나타내는 구조를 연구하기위한 Y. 메르켈 세포 클러스터, arrector의 필리 근육, 피지 분비, 신경 엔딩 4 – 큰 규모의 공간 조직의 한 예는 모낭과 모낭 관련 구조 조정 극성입니다. 모낭은 피부의 평면에 대하여, 그리고 피부의 2 차원 평면 내에 놓여 여포 벡터의 성분과의 각도로 배향되고, 일반적으로 각각 정확하게 판정 몸 축에 대하여 방향을 나타낸다 몸에 위치. 예를 들어, 주동이에서 다시 포인트에 모낭이 꼬리 지느러미하고 발 등의 표면에 머리는 말단에 근위에서 가리 킵니다. 모낭의 방향은 평면 세포 극성 신호에 의해 제어된다 (PCP;라고도 조직의 극성 5). 이 신호 시스템은 초파리에서 발견 된 곳에 작은코어 PCP 유전자 세트 cuticular 털이 털의 방향을 제어하는 것으로 밝혀졌다. EGF는 7 회 G-타입 수용체 1 (Celsr1), 및 방비와 같은 2 (Vangl2를) LAG cadherin의 frizzled 상동 6 (도 FZ6이라 Fzd6는,), – – 코어 PCP 유전자의 세 가지 포유 동물 orthologues 포유류에서 유사한 역할을 피부, 몸의 축이 모낭의 방향을 조정. PCP 신호가없는 상태에서 기본 결함이 여포의 본질적인 구조에 영향을 미치지 않고, 모낭 방향의 초기 무작위 또는 해체 것을 보여 FZ6 녹아웃 마우스 (- – / 이하 FZ6가라고도 Fzd6 tm1Nat)의 연구 6-8. 두 번째 비 PCP 시스템은 윤 생체과 술 등의 대규모 머리 패턴의 생산에 이르게 근처 여포의 지역 정렬을 촉진하기 위해 나중에 역할을합니다.
대규모의 제 2 예피부 내의 공간 조직은 감각 축삭 아버의 형태학에서 볼 수있다. 피부에 신경을 분포시키다 감각 뉴런은 지느러미 루트 및 삼차 신경에 자신의 세포 기관이있다. 이 신경 세포는 온도, 통증, 가려움, 피부 및 머리 9 충돌 기계적 변형의 다양한 유형을 감지합니다. 이들은 축삭 직경 및 전도 속도, 단말 말초 신경 구조, 및 수용체, 채널 및 다른 분자의 발현 패턴에 따라 하위 유형으로 구분 될 수있다. 때문에 피부 내 신경 분포의 높은 밀도, 즉 (하나의 세포 유형이 형광 기자의 식으로 표시되는 경우와 같이) 모든 축삭 (예를 들면, 반대로 신경 미세 섬유 면역 염색) 또는 단일 클래스의도 모든 축삭을 시각화 관련 분석 일반적으로 불가능 개별 정자의 형태를 정의 할 수 있습니다 축색 돌기의 밀도가 중첩는 보여준다. 이 문제를 회피하기 위해, 우리는 매우 드문 드문 유전자 감독 L을 사용했습니다abeling 개별 잘 격리 된 축삭 아버가 조직 화학적 기자, 인간의 태반 알칼리 포스 파타 아제 (10)의 표현에 의해 가시화되는 등의 피부 샘플을 생성한다. 이 방법은 각각의 축삭 아버 형태학의 명확한 시각화 및 형태 학적 기준에 따라 체성 감각 신경 세포 유형의 정의를 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
상기 절개 방법의 숙달은 인내, 침착 함, 그리고 몇 가지 좋은 해부 도구가 필요합니다. 등의 피부 절개는 상대적으로 쉽지만, 꼬리와 발 피부 해부 – 특히 출생 초기 연령에서 – 더 도전합니다. (E15 전에 예) 초기 태아 나이에, 피부가 찢어지지 않도록 제거하기가 어렵습니다. 편리하게, 성장과 생쥐의 피부 구조의 패턴의 많은 연구에 대한 관심의 이벤트 arrector의 필리 근육 (19)의 성?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
References
- Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. . Rook’s Textbook of Dermatology. 8th ed. , (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
- Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
- Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
- Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
- Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
- Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
- Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
- Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
- Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Aal Ertürk, ., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).
