Квартира Гора Визуализация кожу мыши и его применение к анализу Волосяной фолликул паттерна и сенсорной Axon морфологии
Summary
Кожа млекопитающих содержит разнообразные структур – таких как волосяных фолликулов и нервных окончаний – которые отличаются определенным закономерности пространственной организации. Анализируя кожу в виде плоской горе использует в своих интересах 2-мерной геометрии этой ткани для производства полной толщины изображения с высоким разрешением структур кожи.
Abstract
Кожа представляет собой весьма неоднородны ткани. Интра-кожные структуры включают волосяные фолликулы, arrector Пили мышцы, эпидермиса специализации (например, клеточных кластеров Меркель), сальные железы, нервы и нервные окончания и капилляры. Пространственное расположение этих структур строго контролируется на микроскопическом уровне – как видно, например, в упорядоченную структуру типов клеток в пределах одного волосяного фолликула – и на макроскопическом уровне – как видно по почти идентичных ориентаций тысяч волос фолликулы в локальной области кожи. Визуализация этих структур без физического секционирования кожу возможно из-за 2-мерной геометрии этого органа. В этом протоколе, мы показываем, что кожа мыши можно разрезать, фиксированной, проницаемыми, витражи, и пояснил, как нетронутыми двумерного объекта, плоской горе. Протокол позволяет легко визуализации структуры кожи во всей своей полноте через всю толщину больших участках кожи с помощью флажкаческих срезов и реконструкция. Изображения этих структур также может быть интегрирован с информацией о положении и ориентации относительно осей тела.
Introduction
Кожа является одним из крупнейших органов в организме, с важных функций в сомато-ощущения, изоляции / терморегуляции и иммунной защиты 1. Понимание молекулярной и клеточной основу развития кожи и функции была многолетней интерес из-за принципиальной важности кожи как биологической системы и ее значение для дерматологии. Кожа млекопитающих содержит множество многоклеточных структур, в том числе слоистых слоев кератиноцитов, кожной соединительной ткани, нескольких типов волосяных фолликулов, сальных желез, arrector пилей мышц, кровеносных сосудов и, по меньшей мере дюжины различных классов афферентных (сенсорных) и эфферентных нервных волокна (рис. 1). В разных регионах тела связаны с характерно разных типов кожи. У большинства млекопитающих, почти вся поверхность тела покрыта кожей, которая плотно упакованной с волосяных фолликулов. [Люди и голые землекопы составляют исключения йявляется рисунок.] волос отсутствует в ладонной поверхностях рук и ног, которые также связаны со специализированными моделей эпидермиса (dermatoglyphs), железы внешней секреции, а также чувствительных нервных окончаний. Клеточные и молекулярные события, которые контролируют рост, дифференцировку и пространственное расположение клеток в волосяных фолликулах, представляют особый интерес, поскольку каждый фолликул экспонатов, в миниатюре, многие из центральных особенностей органогенеза 2. Эти функции включают в себя существование стволовых клеток и стволовых клеток нишу, точно хореографии миграции клеток и сборку многоклеточных структур из эмбриологически различных компонентов.
В этой статье описываются методы для рассечения, крепление, маркировка, и кожа изображений мышь в качестве неповрежденной двумерного листа, называют "вся гора" или "плоская гора" подготовки. Так как кожа мыши относительно тонкой, можно изображение через всю толщину уплощенной лыжин использованием обычного конфокальной микроскопии. Квартира крепление подход к визуализации кожу млекопитающего технически выгодно, потому что она обходит необходимость физического срезов, тем самым позволяя структуры будет реконструирован полностью оптической срезов. Поскольку почти вся кожа обрабатывается как единый объект, квартиры смонтировать подход также облегчает съемку нескольких участках поверхности тела, сохраняя информацию о положении и ориентации относительно осей тела. Наконец, структуры внутри кожи, как правило, присутствует в модели, которые повторяются через определенные промежутки времени, облегчая тем самым коллекцию изображений с нескольких представителей данной структуры. Эти характеристики знакомы нейробиологов, которые работают на сетчатке, двумерной части центральной нервной системы, которая пользуется аналогичные преимущества для изучения нейронной морфологии 3.
Квартира смонтировать Описанный здесь подход имеет особое utilitY для изучения структуры, которые обладают пространственной организации на относительно больших масштабах в течение двумерной плоскости кожи. Одним из примеров масштабного пространственной организации является скоординированное полярность волосяных фолликулов и волосяных фолликул связанных структур – кластеров клеток Меркеля, arrector Пили мышц, сальных желез и нервных окончаний 4. Фолликулы волос ориентированы под углом по отношению к плоскости кожи, и компонент вектора фолликула, которая лежит в пределах 2-мерной плоскости кожи обычно проявляет ориентацию относительно осей тела, которое точно определяется для каждого Положение на теле. Например, волосяные фолликулы на задней точки от ростральнее до основания хвостового и волосы на спинной поверхности ног указывают от проксимальных к дистальным. Волосы ориентация фолликул контролируется плоской сигнализации клеточной полярности (PCP; также называется ткань полярности 5). Эта система сигнализации было обнаружено у дрозофилы, где небольшоенабор основных генов PCP было установлено, управлять ориентацией кутикулярных волосками и щетинками. Три ортологами млекопитающих из основных генов PCP – Frizzled гомологов 6 (Fzd6, также упоминается как FZ6), кадгерином ЭФР LAG семь частот G-типа рецептора 1 (Celsr1) и Ванг-как 2 (Vangl2) – играть аналогичные роли в млекопитающих кожа, координации ориентации волосяных фолликулов с осями тела. Исследования FZ6 мышей с (Fzd6 tm1Nat, далее по тексту FZ6 – / -) показывают, что первичный дефект при отсутствии PCP сигнализации является начальным рандомизации или дезорганизация ориентации волосяного фолликула, при отсутствии эффекта от внутренней структуры фолликулов 6-8. Вторая система не-РСР действует позже содействовать развитию местной выравнивание близлежащих фолликулов, что приводит к производству крупномасштабных волос шаблонов, таких как оборотах и пучки.
Второй пример крупномасштабногопространственная организация в коже проявляется в морфологии сенсорных аксонов беседок. Сенсорные нейроны, которые иннервируют кожу имеют свои клеточных тел в корне спинной и тройничного ганглиев. Эти нейроны обнаружить температуру, боль, зуд, а также различные типы механических деформаций, падающего на кожу и волосы 9. Их можно разделить на подтипы на основе диаметра аксона и скорости проводимости, терминала структуры нервных окончаний, и паттернов экспрессии рецепторов, каналов и других молекул. Из-за высокой плотности иннервации в коже, анализирует, которые включают все аксоны визуализации (например, анти-нейрофиламентов иммунное окрашивание) или даже все аксоны из одного класса (как видно, когда один тип клеток отмечена при экспрессии флуоресцентного репортера) как правило, показывает плотное наложение аксонов, которые делает невозможным определить морфологию индивидуальной беседке. Чтобы обойти эту проблему, мы использовали очень разреженный генетически-направленный лabeling производить спинной образцы кожи, в которой отдельные хорошо изолированы аксонов оправки визуализируются путем экспрессии репортера гистохимических, человеческой плацентарной щелочной фосфатазы 10. Данный подход позволяет однозначно визуализацию отдельных морфологии аксона беседка и определение типов соматосенсорной нейронных основе морфологических критериев.
Protocol
Representative Results
Discussion
Овладение методами рассечение описанных выше требуется только терпение, твердая рука, и несколько хороших инструментов рассечение. Рассечение кожу спины сравнительно легко, но хвост и кожи ног вскрытия – особенно на ранних послеродовых возрастов – являются более сложными. На ранних пр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Amir Rattner for helpful comments on the manuscript. Supported by the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 5-bromo-4-chloro-indolyl phosphate (BCIP) | Roche | 11383221001 | |
| AM1-43 | Biotium | 70024 | |
| AM4-65 | Biotium | 70039 | |
| Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
| Benzyl benzoate | Sigma | B-6630 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Cy3-alpha smooth muscle actin antibody | Sigma | C6198 | 1:400 |
| Cytokeratin-8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-c | 1:500 |
| Dissecting microscope | |||
| Dissection tools | Fine Science Tools | scissors and forceps | |
| Electric razor | |||
| Fluoromount G | EM Sciences | 17984-25 | |
| Formalin | Sigma | HT501320 | |
| Glass dishes | Pyrex | 6 cm and 10 cm diameter | |
| Glass plates | Amersham Biosciences | SE202P-10 | 10 cm x 8 cm x 1 mm |
| Hair remover | Nair | ||
| Horizontal rotating platform | Hoefer | PR250 Orbital shaker | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma | K113 | |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Roche | 11383213001 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Razor Blades | VWR | 55411-055 | |
| Secondary antibodies | Invitrogen | Alexa-dye conjugated | |
| Sylgard-184 | Fisher Scientific | NC9020938 | |
| Tissue culture plastic dishes | 10 cm diameter | ||
| Tissue culture plates | 6- and 12-well |
References
- Burns, T., Breathnach, S., Cox, N., Griffiths, C. . Rook’s Textbook of Dermatology. 8th ed. , (2010).
- Lee, J., Tumbar, T. Hairy tale of signaling in hair follicle development and cycling. Semin. Cell Dev. Biol. 23, 906-916 (2012).
- Masland, R. H. The neuronal organization of the retina. Neuron. 76, 266-280 (2012).
- Chang, H., Nathans, J. Responses of hair follicle-associated structures to loss of planar cell polarity signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, (2013).
- Wallingford, J. B. Planar cell polarity and the developmental control of cell behavior in vertebrate embryos. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 28, 627-653 (2012).
- Guo, N., Hawkins, C., Nathans, J. Frizzled6 controls hair patterning in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 9277-9281 (2004).
- Wang, Y., Badea, T., Nathans, J. Order from disorder: Self-organization in mammalian hair patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 19800-19805 (2006).
- Wang, Y., Chang, H., Nathans, J. When whorls collide: the development of hair patterns in frizzled 6 mutant mice. Development. 137, 4091-4099 (2010).
- Lumpkin, E. A., Caterina, M. J. Mechanisms of sensory transduction in the skin. Nature. 445, 858-865 (2007).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, (2012).
- Bianchi, N., Depianto, D., McGowan, K., Gu, C., Coulombe, P. A. Exploiting the keratin 17 gene promoter to visualize live cells in epithelial appendages of mice. Mol. Cell. Biol. 25, 7249-7259 (2005).
- Alonso, L., Fuchs, E. The hair cycle. J. Cell Sci. 119, 391-393 (2006).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 30, 5241-5255 (2003).
- Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse. J. Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).
- Rotolo, T., Smallwood, P. M., Williams, J., Nathans, J. Genetically-directed, cell type-specific sparse labeling for the analysis of neuronal morphology. PLoS One. 3, (2008).
- Devenport, D., Fuchs, E. Planar polarization in embryonic epidermis orchestrates global asymmetric morphogenesis of hair follicles. Nat. Cell Biol. 10, 1257-1268 (2008).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147, 1615-1627 (2011).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Fujiwara, H., et al. The basement membrane of hair follicle stem cells is a muscle cell niche. Cell. 144, 577-589 (2011).
- Orsini, M. W. Technique of preparation, study and photography of benzyl-benzoate cleared material for embryological studies. J. Reprod. Fertil. 3, 283-287 (1962).
- Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
- Aal Ertürk, ., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat. Methods. 10, 508-513 (2013).
