Immunodetection של החלבונים בממברנה חיצוניים על ידי cytometry הזרימה של מיטוכונדריה מבודדת
Summary
שתואר כאן הוא שיטה לאיתור וללכמת חלבוני קרום חיצוני של המיטוכונדריה ידי immunolabeling של מיטוכונדריה מבודדת מרקמת מכרסמים וניתוח על ידי cytometry זרימה. שיטה זו ניתנת להארכה על מנת להעריך היבטים פונקציונליים של אוכלוסיות המיטוכונדריה.
Abstract
שיטות לאיתור ולמעקב אחר רכיבי חלבון קרום חיצוניים של המיטוכונדריה ברקמות של בעלי חיים הן חיוניות כדי ללמוד פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של המיטוכונדריה. פרוטוקול זה מתאר טכניקה שבה מיטוכונדריה מבודדת מרקמת מכרסם הם immunolabeled ונותחה על ידי cytometry זרימה. המיטוכונדריה הוא מבודד מחוט השדרה של מכרסמים ונתונים לצעד העשרה מהיר כדי להסיר מיאלין, חומר מזהם ביותר של שברים במיטוכונדריה הוכנו מרקמת עצבים. אז מיטוכונדריה המבודדת מסומנות עם נוגדן של בחירה ונוגדנים משני מצומדות fluorescently. ניתוח על ידי cytometry זרימה מאמת את טוהר היחסי של הכנות המיטוכונדריה על ידי צביעה עם צבע ספציפי של המיטוכונדריה, ואחריו איתור וכימות של חלבון immunolabeled. טכניקה זו היא מהירה, לכימות ותפוקה גבוהה, המאפשר לניתוח של מאות אלפי מיטוכונדריה לדגימה. זה ישים להערכת p רומןroteins על פני השטח של המיטוכונדריה בתנאים פיסיולוגיים נורמלים, כמו גם חלבונים שעשויות להפוך mislocalized לאברון זה בפתולוגיה. חשוב לציין, בשיטה זו ניתן מצמידים את צבעי מחוון ניאון כדי לדווח על פעילויות מסוימות של אוכלוסיות המיטוכונדריה ואינה ריאלי למיטוכונדריה ממערכת העצבים המרכזית (מוח וחוט השדרה), כמו גם בכבד.
Introduction
המיטוכונדריה הם אברונים מאוד דינמיים שעוברים סבבים רבים של ביקוע והיתוך, מועברים לאתרים של ביקוש לאנרגיה גבוהה ולהגיב במהירות לגירויים פיסיולוגיים 1. מאז הוא מוכר מיטוכונדריה שיותר ויותר בתוך רקמות שונות, תאים סלולריים שונים אפילו, יש לי פרופילים תפקודיים שונים, יש צורך בשיטות חדשות לזיהוי תת המיטוכונדריה השונה אלה.
מיקרוסקופית מספקת אמצעי לפיו ניתן דמיין המיטוכונדריה פרט ואת הנוכחות של חלבון באו במיטוכונדריה יכול להיקבע על ידי immunofluorescence 2. עם זאת, ניתוח כמותי בשיטה זו הוא עבודה אינטנסיבית ומתאים יותר לניסויים באמצעות שורות תאים הונצחו או עיקריות. המחקר של המיטוכונדריה פרט נגזרת מרקמות הוא באופן משמעותי יותר קשה ורוב השיטות אינן מאפשרות זיהוי קל של תת המיטוכונדריה במקביל לevaluני של פונקציה של המיטוכונדריה 3.
כדי להתמודד עם המשוכה הזאת, שיטה חדשנית לimmunolabel מיטוכונדריה מבודדת מרקמות מכרסמים ולאחר מכן נותחה על ידי cytometry זרימה פותח. זה מאפשר לאיתור והכימות של חלבונים מקומיים לקרום החיצוני של המיטוכונדריה, אשר בהשוואה לניתוח על ידי מיקרוסקופ המהיר, היא הרבה פחות עבודה אינטנסיבית ומאפשרת הניתוח של אלפי מיטוכונדריה במדגם יחיד. assay זה יכול להיות מיושם כדי לפקח על הגורל וכמות היחסית של חלבוני קרום החיצוניים של המיטוכונדריה שנחשבים לconstitutively נוכח במיטוכונדריה, הגיוס של חלבונים על פני השטח של המיטוכונדריה, או זיהוי של חלבוני mislocalized למיטוכונדריה במצבים פתולוגיים. יתר על כן, השילוב של צבעי מחוון ניאון קונבנציונליים מאפשר ההערכה בו זמנית של היבטים מסוימים של תפקוד המיטוכונדריה בהמיטוכונדריה שונהאוכלוסיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה בא לידי ביטוי יותר ויותר כי המיטוכונדריה הן שחקני מפתח בשני פיזיולוגיה ומחלות נורמליות. בעוד immunoblotting יכול לקבוע אילו חלבונים נמצאים בתוך המיטוכונדריה או על פני השטח של המיטוכונדריה במצב מסוים, דיווחים בשיטה זו בממוצע של האוכלוסייה כולה. שיטה זו לא יכולה להניב מיד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לורי Destroismaisons ושרה Peyrard לתמיכה טכנית יוצאת מן הכלל וDr.Alexandre פרת לגישה לcytometer הזרימה. אנחנו רוצים גם להודות ד"ר טימותי מילר על תרומתו בעניין הסרת המיאלין מההכנות. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) Neuromuscular מחקר שותפות, קרן הקנדית לחדשנות, חברת ALS של קנדה, הקרן פריק לחקר ALS, צ'אם קרן וFonds דה לה המשוכלל והנדיר en סנטה du קוויבק (CVV). CVV וNA שניהם מחקר חוקרים של Fonds דה לה משוכלל ונדיר en סנטה du קוויבק וCIHR חדשים חוקרים. SP נתמך על ידי טים הנואלים Studentship מהחברה ALS של קנדה.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coultier | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex490 nm/Em516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex548 nm/Em574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex540 nm/Em600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BS FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
- Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).
- Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots. Circ Res. 95, 239-252 (2004).
- Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).
- Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria. Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
- Xu, X., Arriaga, E. A. Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine. Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).
- Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. New insights into the function and regulation of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).
- Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H., Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1. Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).
- Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell. 1, 515-525 (2001).
- West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).
- Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).
- Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4, 2550 (2013).
