İzole Mitokondri Akış Sitometrisi ile Dış Zar Proteinleri imüno
Summary
Burada açıklanan tespit ve akış sitometrisi ile analiz kemirgen doku ve izole mitokondri immün ile mitokondriyal dış membran proteinleri ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, mitokondriyal alt popülasyonlarının fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için genişletilebilir.
Abstract
Yöntem algılamak ve hayvansal dokular mitokondriyal fizyolojisi ve patofizyolojisi çalışma için hayati olan mitokondriyal dış membran proteini bileşenleri izlemek için. Bu protokol kemirgen dokusundan izole mitokondri immunolabeled ve flow sitometri ile analiz edilir bir yöntem açıklanır. Mitokondri kemirgen omurilik izole edildi ve miyelin, sinir dokusundan hazırlanan mitokondriyal parçaların büyük bir kirletici maddeyi bertaraf edilmesi için hızlı bir zenginleştirme adımına tabi tutulurlar. İzole mitokondri daha sonra tercih edilen bir antikoru ve bir floresan konjuge sekonder antikor ile etiketlenir. Akış sitometrisi ile analiz, algılama ve imüno-işaretli protein miktarının ölçülmesi ile takip mitokondriyal belirli bir boya ile boyanması ile mitokondriyal preparatların saflığı göreli doğrular. Bu teknik, numune başına mitokondri yüzbinlerce analizine izin veren, hızlı ölçülebilir ve yüksek verimli olduğunu. Bu yeni p değerlendirmek için geçerlidirNormal fizyolojik şartlar altında mitokondrial yüzeyinde roteinler gibi patoloji sırasında bu organele mislocalized olabilir proteinleri. Önemli olarak, bu yöntem, alt-popülasyonlarının mitokondriyal bazı etkinlikler rapor floresan göstergesi boyalar ile birleştirilebilir ve merkezi sinir sistemi (beyin ve omurilik) yanı sıra karaciğer, mitokondri için mümkün olduğunu edilebilir.
Introduction
Mitokondri, yüksek enerji talebinin sitelerine taşınan ve fizyolojik uyaranlara 1 hızla yanıt olan, fizyon ve füzyon birden fazla tur geçmesi son derece dinamik organellerdir. Giderek farklı dokularda olduğu mitokondri kabul edildiğinden, hatta farklı hücre bölmeleri, yeni yöntemler bu farklı mitokondriyal alt kümelerini tanımlamak için gerekli olan, farklı fonksiyonel profilleri var.
Mikroskopi bireysel mitokondri görselleştirilebilir sağlayan bir aracı ve bağışıklık 2 ile belirlenebilir veya mitokondrilerde bir proteinin varlığını içerir. Bununla birlikte, bu yöntem ile kantitatif analiz, emek yoğun ve ölümsüzleştirilmiş veya primer hücre çizgileri kullanılarak deneyler için daha uygundur. Dokusundan türetilen bireysel mitokondri çalışması çok daha zordur ve çok yöntem ile aynı zamanda mitokondriyal değerlendirmeleri mevcuttur alt gruplarının kolay tanımlama için izin vermezmitokondriyal fonksiyon 3 tirme.
Bu engel, akış sitometrisi ile kemirgen dokulardan izole edildi ve daha sonra analiz mitokondri immunolabel için yeni bir metot gidermek amacıyla geliştirilmiştir. Bu, hızlı bir şekilde saptanması ve mikroskobik inceleme ile karşılaştırıldığında mitokondriyal dış membran, lokalize proteinler ölçülmesini sağlar, daha az emek yoğun ve tek bir numunede bulunan mitokondri binlerce analiz edilmesini sağlar. Bu deney, mitokondri de yapısal olarak mevcut olduğu düşünülmektedir mitokondriyal dış zar proteinlerinin 'nin ve nispi miktarını izlemek için uygulanabilir, mitokondriyal yüzeyine proteinler işe ya da patolojik koşulların mitokondrilere mislocalized proteinlerin tespiti. Ayrıca, geleneksel floresan gösterge boyaların kuruluş farklı mitokondriyal mitokondriyal fonksiyonun bazı yönlerinin aynı anda değerlendirilmesini sağlarsubpopülasyonunun.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu mitokondri normal fizyoloji ve hastalık hem de kilit oyuncular olduğu giderek açıktır. Imünoblotting, belli bir durumda mitokondri içinde veya mitokondriyal yüzeyinde tüm nüfusun ortalama bu yöntem raporlar bulundu hangi proteinlerdir çıkarabilirler. Bu yöntem mitokondriyal alt popülasyonlarının veya altkümelerin göreceli bolluk hakkında bilgi elde edemez. O olmuştur iken daha önce tüm mitokondri eşit, alan giderek bir hücre içinde bu mitokondri kabulüdür oluşturulan morfolojisi ve / veya…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz sitometresi akış erişimi için Laurie Destroismaisons ve üstün teknik destek için Sarah PEYRARD ve Dr.Alexandre Prat teşekkür ederiz. Biz de hazırlıkları miyelin kaldırılması ile ilgili yaptığı katkılarından dolayı Dr Timothy Miller kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık Araştırması (CIHR) Nöromusküler Araştırma Ortaklığı, Yenilik için Kanada Vakfı, Kanada ALS Derneği, ALS Araştırma Frick Vakfı, CHUM Vakfı ve Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV) olan Kanada Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Hem CVV ve NA olan Araştırma Âlimler Fonds de la Recherche en Santé du Québec ve CIHR Yeni Müfettişler. SP Kanada ALS Derneği'nin Tim Noël Öğrencilik tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coultier | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex490 nm/Em516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex548 nm/Em574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex540 nm/Em600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BS FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
- Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).
- Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots. Circ Res. 95, 239-252 (2004).
- Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).
- Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria. Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
- Xu, X., Arriaga, E. A. Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine. Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).
- Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. New insights into the function and regulation of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).
- Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H., Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1. Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).
- Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell. 1, 515-525 (2001).
- West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).
- Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).
- Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4, 2550 (2013).
