Temps réel Mesures de Membrane Protein Receptor Interactions: Utilisation de résonance plasmonique de surface (SPR)
Summary
Résonance plasmonique de surface (SPR) est une méthode sans étiquette pour la détection des interactions biomoléculaires en temps réel. Ici, un protocole pour une protéine de la membrane: expérience de l'interaction du récepteur est décrite, tout en discutant les avantages et les inconvénients de la technique.
Abstract
Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed ‘ligand’) is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the ‘analyte’) is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method’s high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter’s cognate substrate binding protein).
Introduction
Les interactions protéine-protéine (PPI); la formation et la dissociation des complexes de protéines, sont des événements clés dans de nombreux processus biologiques (par exemple, la replication, la transcription, la traduction, la signalisation, la communication cellule-cellule). Études semi-quantitative de PPI sont souvent effectuées à l'aide déroulant ou expériences immuno-précipitation. Cependant, ces techniques (et similaires) sont limités dans la gamme des affinités qui peut être mesurée (à faible et une plus grande affinité micromolaire) en raison des étapes de lavage qui sont inhérents à ces techniques. Ces techniques "point final" ne peuvent pas identifier les interactions d'affinité transitoires ou basses qui sont souvent de grandes conséquences biologiques. En outre, la résolution temporelle de ces approches est extrêmement limitée, généralement ordres de grandeur plus lent que les taux de la réaction. SPR surmonte ces lacunes en raison de sa sensibilité accrue et une résolution temporelle supérieure 1,2. SPR est un procédé sans étiquette, et en tant que telinteraction moléculaire peut être mesurée (à condition que les changements de masse peuvent être détectées). En plus de l'IPP, il a été largement utilisée pour caractériser la protéine-ligand, protéine-médicament (ou une petite molécule), la protéine-ADN et les interactions protéine-ARN 3-5. Les résultats sont enregistrés et tracés en temps réel, ce qui permet la modification rapide des conditions expérimentales et la conception expérimentale flexible.
Le principe physique derrière instruments basés SPR est l'utilisation d'un système optique qui mesure un changement de l'indice de réfraction sur la surface du capteur change masse sur deux. L'un des partenaires d'interaction de ligands (ci-après) est immobilisée sur une puce à matrice de polymère et la deuxième molécule (ci-après analyte) est coulé sur la surface. Analyte liaison au ligand modifie la masse sur la surface de la puce. Ce changement de masse est directement liée et proportionnellement à l'évolution de l'indice de réfraction de la surface. Les résultats sont tracés en temps réel etprésenté sous forme d'unités de réponse (RU) en fonction du temps. Un tel complot est appelé sensogramme (par exemple, la figure 1). Depuis SPR suit le cours du temps complet de l'interaction, de pré-équilibre constantes cinétiques sont dérivés, en plus de l'équilibre affinités. Comme détaillé ci-dessous, le comportement d'un système donné pré-équilibre détient beaucoup d'informations, et offre une perspective très différente de l'équilibre seul. Une fois que le système est étalonné, des expériences sont très rapides et ne ont besoin que de petites quantités de matière protéique (microgramme à des quantités nanogramme). La collecte de l'information cinétique complète d'un système donné peut être réalisé en quelques jours. La grande sensibilité de SPR offre mesures qui ne sont pas possible en utilisant toute autre technique 6. Cependant, cette sensibilité élevée est une «arme à double tranchant» car il peut être une source importante pour les données faussement positifs. Tout facteur qui affecte l'indice de réflexion est enregistrée et tracée sur l'sensogramme. En tant que tel, apcontrôles propriées doivent être utilisés pour éliminer les faux positifs, et le soutien des approches complémentaires est fortement conseillé.
La figure 1 illustre la progression d'une expérience SPR utilisant une puce de capteur revêtue de NTA. Le Sensogramme dans le panneau A montre l'injection des ions nickel sur la matrice NTA (données non soustraites), et des panneaux BD afficher les données après la soustraction du signal dérivé à partir de la cellule témoin négatif. Flèches rouges et bleus montrent début d'injection et à la fin, respectivement. Immobilisation du ligand sur la puce modifie progressivement la masse jusqu'à ce que l'injection est terminée. Le plateau stable observée après la fin de l'injection de ligand reflète l'association stable du ligand à la surface (figure 1B, le cycle 2). Une fois une ligne de base stable soit atteint, un tampon est injecté sur le ligand et la cellule de référence (figure 1B, cycle 3) .Cet injection sert de «contrôle à blanc", et serasoustrait lors de l'analyse. Lors de l'injection, des changements mineurs sont enregistrés, ce qui reflète un flux de masse à travers la puce. Ensuite, dans un cycle séparé (figure 1B, le cycle 4), l'analyte est injectée; l'augmentation progressive de RU représente l'association de l'analyte au ligand. Les sites de liaison deviennent progressivement occupées jusqu'à ce qu'un équilibre soit atteint. Dès que se termine l'injection, une diminution de EF reflète la dissociation du complexe. De tels sensograms constantes de vitesse pré-équilibre et d'équilibre peuvent être dérivées (voir plus loin). La figure 1 représente une interaction transitoire entre le ligand et l'analyte. Lorsque l'interaction est plus stable, la baisse du niveau RU est plus lent, reflétant une plus faible k d.
Nous décrivons ici une expérience SPR visant à caractériser l'interaction entre un transporteur membranaire (détergent solubilisé) et son partenaire fonctionnelle, son substrat apparenté protéines 6,7 contraignant. Le mod choisiel est un système ATP binding cassette (ABC) transporteur, ModBC-A de Archeaglobus fulgidus. Ce système a été choisi pour ses résultats hautement reproductibles, haute rapport signal sur bruit, et classique "on / off" taux. En outre, les transporteurs ABC homologues sont disponibles pour servir de témoins négatifs importants. Le transporteur, ModBC (ligand A) est extrait de la membrane avec un détergent, purifiée et immobilisée sur la puce. Son partenaire d'interaction soluble, moda, est l'analyte. Comme un ligand témoin négatif, un transporteur ABC différente RbsBC est utilisé ("ligand B").
Protocol
Representative Results
Discussion
SPR est une méthode très sensible pour étudier les interactions moléculaires, et est souvent la seule approche qui permet la surveillance en temps réel des interactions transitoires (mais importantes). Un exemple est l'interaction transitoire présentée ici, qui ne pouvait pas être détecté par toute autre méthode (dosages déroulants, liposomes sédimentation essais 6). De plus, tandis que d'autres procédés sont limités à l'équilibre des mesures (que ce soit quantitative ou qualitat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007–47——N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
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- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
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