膜タンパク質のリアルタイム測定：受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴を使用した（SPR）
Summary
表面プラズモン共鳴（SPR）は、リアルタイムでの生体分子相互作用を検出するためのラベルフリー法である。ここで、膜タンパク質のためのプロトコル：技術の長所と短所を議論しながら、受容体相互作用の実験は、記載されている。
Abstract
Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed ‘ligand’) is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the ‘analyte’) is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method’s high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter’s cognate substrate binding protein).
Introduction
タンパク質 – タンパク質相互作用（PPI）タンパク質複合体の形成および解離は、多くの生物学的プロセスにおいて重要な事象（ 例えば 、複製、転写、翻訳、シグナル伝達、細胞間コミュニケーション）である。 PPIの半定量的研究は、多くの場合、プルダウンまたは免疫沈降実験を用いて行われる。しかしながら、これらの（および類似の）技術により、このような技術に固有の洗浄工程に（低マイクロモルより高い親和性）を測定することができる親和性の範囲が限られている。このような「エンドポイント」技術は、多くの場合、大きな生物学的結果のある一過性または低親和性相互作用を同定することはできない。さらに、このようなアプローチの時間分解能は、反応の速度より通常数桁遅い極めて限られている。 SPRは、その高まり感度と優れた時間分解能1,2に、これらの欠点を克服する。 SPRは、ラベルフリーの方法であり、等（質量変化を検出することができる限り、）分子相互作用を測定することができる。 PPIに加えて、広範囲のタンパク質-リガンド、タンパク質-薬物（または小分子）、タンパク質、DNA、およびタンパク質-RNA相互作用3-5を特徴付けるために使用されている。結果は、実験条件と柔軟な実験設計の迅速な変更を可能にする、リアルタイムで記録し、プロットした。
SPRベースの計測器の背後にある物理的原理は、2を変更質量にセンサ表面に屈折率の変化を測定する光学系の利用である。相互作用パートナー（以下、リガンド）の一つは、ポリマーマトリックスチップと第二の分子（以下、分析物）の表面上に流している上に固定されている。リガンドに結合する分析物は、チップ表面上の質量を変化させる。この質量変化は、直接的に比例して表面の屈折率の変化に関連している。結果をリアルタイムでプロットし、時間の関数として応答単位（RU）として提示する。このようなプロットは、センサーグラムと呼ばれる（ 例えば 、 図1）。 SPRは、相互作用の完全な時間経過をたどるので、予め平衡反応速度定数は親和性を平衡に加えて、導出される。以下に詳述されるように、与えられたシステムのプレ平衡挙動は、多くの情報を保持しており、単独の均衡よりも非常に異なる視点を提供します。システムが校正されると、実験は非常に高速であり、タンパク質材料（金額ナノグラムするマイクログラム）を少量しか必要とします。与えられたシステムの完全な運動情報を収集する日で達成することができる。 SPRの高感度は、他の技法6を使用して可能でない測定値が得られる。しかし、この高感度は、偽陽性のデータのための主要な源とすることができるので、「両刃の剣」である。反射率に影響を与える要因を記録し、センサーグラム上にプロットされている。そのような、APとしてpropriateコントロールは、偽陽性を排除するために使用されなければならない、と補完的なアプローチからの支援を強くお勧めします。
図1は NTAでコーティングされたセンサーチップを用いたSPR実験の進行を示している。パネルAのセンソグラムはNTAマトリックス（非サブトラクションデータ）上のニッケルイオンの注入を示し、パネルはBDは、陰性対照細胞由来の信号を減算した後にデータを表示する。赤と青の矢印は、注入の開始と終了を示す。注入が終了するまで、チップ上へのリガンドの固定化は徐々に質量を変化させる。リガンドの噴射の終了後に観察され、安定した高原は、表面へのリガンド（ 図1B、サイクル2）の安定な会合を反映している。安定なベースラインが達成されると、バッファは、リガンド上に注入し、基準セル（ 図1B、サイクル3）。この注射は、「ブランクコントロール」として機能しているであろう分析中に差し引か。注射の際、多少の変更は、チップを通して質量の流れを反映して、記録されている。その後、独立したサイクル（ 図1B、サイクル4）で、分析物を注入されます。 RUの緩やかな増加は、リガンドへの検体の関連を表します。平衡に達するまで、結合部位は、徐々に占有になる。とすぐに注入が終了すると、RUはの低下が複雑なの解離を反映している。予備平衡平衡速度定数を導出することができるようなセンサーグラムから（後述）。 図1は、リガンドとアナライトとの間の過渡的な相互作用を示している。相互作用がより安定しているとき、RUレベルの減少はより低いk dを反映遅い。
ここで、我々は、その同族基質タンパク質6,7結合膜輸送（洗剤が可溶化）とその機能的パートナーとの相互作用を特徴づけることを目的としSPR実験について説明します。選ばれたMODエル·システムは、ATP結合カセット（ABC）トランスポーター、ArcheaglobusのフルギダスのModBC-Aである。このシステムは、信号対雑音比、および古典的な「オン/オフ」速度にその再現性の高い結果が、高信号のために選択した。さらに、同族体ABCトランスポーターが重要な負の対照として役立つために利用可能である。トランスポーター、ModBC（配位子A）がチップ上に精製し、固定化され、界面活性剤を用いて膜から抽出される。その可溶性相互作用パートナー、MODAは、分析対象である。陰性対照リガンドとして、別のABCトランスポーターRbsBCは（「リガンドB」）が使用されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
SPRは、分子相互作用を研究するための高感度な方法であり、多くの場合、一過性の（まだ重要な）相互作用のリアルタイム監視を提供する唯一のアプローチである。例は、他の方法（プルダウンアッセイ、リポソーム沈降アッセイ6）によって検出することができなかった、本明細書に提示過渡相互作用である。他の方法（定量的または定性的のいずれか）の測定値を平衡に制限され…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007–47——N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
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