Membran Protein Gerçek zamanlı ölçümler: Reseptör Etkileşimleri Yüzey Plazmon Rezonans Kullanma (SPR)
Summary
Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) gerçek zamanlı biyomoleküler etkileşimlerini tespit etmek için bir etiket içermeyen bir yöntemdir. Burada, bir membran proteini için bir protokol: tekniğin artılarını ve eksilerini tartışırken reseptör etkileşimi deney, tarif edilmektedir.
Abstract
Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed ‘ligand’) is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the ‘analyte’) is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method’s high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods.
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter’s cognate substrate binding protein).
Introduction
Protein-protein etkileşimleri (ÜFE); oluşumu ve protein kompleksleri ayrışma, birçok biyolojik süreçler (örneğin, replikasyon, transkripsiyon, çeviri, sinyal, hücre-hücre iletişim) anahtar olaylardır. ÜFE Yarı kantitatif çalışmalar genellikle çekme-aşağı veya immün-yağış deneyleri kullanılarak yapılmaktadır. Bununla birlikte, bu (ve benzeri) teknikleri nedeniyle bu tür teknikler doğasında olan yıkama adımları için ölçülebilir afinite aralığında (düşük mikromolar ve daha yüksek afinite) sınırlıdır. Bu tür "son nokta" teknikleri genellikle büyük biyolojik sonuçları vardır geçici veya düşük afinite etkileşimleri tespit edemez. Buna ek olarak, bu yaklaşımların zamansal çözünürlüğü derece, reaksiyon oranlarının daha yavaş büyüklük genellikle sipariş sınırlıdır. SPR nedeniyle artan hassasiyet ve üst temporal çözünürlük 1,2 bu eksikliklerin üstesinden gelir. SPR gibi ve bir etiket içermeyen bir yöntemdir(kütle değişiklikleri tespit edilebilir olduğu sürece) moleküler etkileşim ölçülebilir. PPI ek olarak, geniş bir protein-ligand ve protein-ilaç (veya küçük molekülü) ve protein-DNA ve protein-RNA etkileşimi 3-5 karakterize etmek için kullanılmaktadır. Sonuçlar kaydedildi ve deneysel koşullar ve esnek deneysel tasarım hızlı değiştirilmesini sağlar gerçek zamanlı, çizilir.
SPR temelli araçların arkasında fiziksel prensibi kütle 2 değiştirir üzerine sensör yüzeyinde kırılma endeksi bir değişiklik ölçen bir optik sistemin kullanılmasıdır. Etkileşim ortakları (bundan sonra ligand) biri polimer matris çip ve ikinci molekülün (bundan sonra analit) yüzey üzerinde aktı üzerine immobilize edilir. Analit, liganda çip yüzeyi üzerinde kitle değiştirir. Bu kütle değişim, doğrudan ve oransal yüzeyin kırılma indeksi değişikliklerle ilgilidir. Sonuçlar, gerçek zamanlı olarak çizilir vezamanın bir fonksiyonu olarak cevap birimleri (RU) olarak sunulmuştur. Böyle bir komplo, bir sensogram olarak adlandırılır (örneğin, Şekil 1). SPR etkileşimi tamamen zaman sürecini takip ettiğinden ön denge kinetik hız sabitleri afinitelere denge ek olarak elde edilir. Aşağıda ayrıntılı olarak, belirli bir sistemin ön denge davranışı çok bilgi tutar ve yalnız denge çok farklı bir bakış açısı sağlar. Sistem kalibre sonra, deneyler çok hızlı ve (tutarlar nanogram için mikrogram) protein malzemesinin sadece küçük miktarlarda gerektirir. Verilen bir sistemin kinetik bilgi toplanması gün içinde elde edilebilir. SPR yüksek hassasiyet başka bir teknik kullanılarak 6 mümkün değildir ölçümleri tanıyor. Ancak, bu yüksek hassasiyet yanlış pozitif veriler için önemli bir kaynak olabilir çünkü bir 'iki ucu keskin bir kılıç "dir. Yansıtıcı endeksi etkileyen herhangi bir faktör kaydedildi ve sensogram üzerine çizilir. Örneğin, ap Adıpropriate kontrolleri yanlış pozitif ortadan kaldırmak için kullanılması gerekir, ve tamamlayıcı yaklaşımlar destek son derece tavsiye edilir.
Şekil 1, bir NTA-kaplı sensör çipi kullanan bir SPR deney ilerlemesini göstermektedir. Panel A sensogram NTA matris üzerinden nikel iyonlarının (çıkartılmamış veri) enjeksiyonu gösterir ve paneller BD negatif kontrol hücresinden elde edilen sinyal çıkarıldıktan sonra verileri görüntüler. Kırmızı ve mavi oklar sırasıyla, enjeksiyon başlangıç ve bitiş göstermektedir. Enjeksiyon sona kadar çip üzerine ligand İmmobilizasyonu yavaş yavaş kitle değiştirir. ligandın enjeksiyon sona ermesinden sonra gözlenen istikrarlı plato yüzeyi (Şekil 1B, çevrim 2) ligand istikrarlı bir ilişki yansıtır. Istikrarlı bir temel elde edildikten sonra bir tampon ligand ve .Bu enjeksiyon bir 'boş kontrolü "olarak hizmet vermektedir referans hücresi (döngüsü 3 Şekil 1B) üzerine enjekte edilir, ve olacaktırAnaliz sırasında çıkarılır. Enjeksiyon üzerine, küçük değişiklikler çip sayesinde kitle akışını yansıtan, kaydedilir. Daha sonra, ayrı bir döngü (Şekil 1B, program 4) içinde, analit, enjekte edilir; RU kademeli artış bağına Analitin dernek temsil eder. dengeye ulaşana kadar, bağlanma yerleri yavaş yavaş işgal hale gelir. En kısa sürede enjeksiyon biter gibi, RUs bir düşüş Kompleksin ayrışma yansıtır. Ön denge ve denge hız sabitleri elde edilebilir tür öz sensogramlar itibaren. (Daha sonra bakın) 1 ligand ve analit arasındaki geçici etkileşim tasvir Şekil. Etkileşim daha stabil olduğunda, RU düzeyinde düşüş daha düşük bir k d yansıtan, yavaştır.
Bu yazıda, aynı kökten gelen substrat proteini 6,7 bağlayıcı bir membran taşıyıcısı (deterjan çözülebilir) ve fonksiyonel ortağı arasındaki etkileşimi karakterize amaçlayan bir SPR deney tarif. seçilen model sistem, bir ATP bağlama kaseti (ABC), taşıyıcı, Archeaglobus fulgidus arasında ModBC-A'dır. Bu sistem oranları 'on / off', onun yüksek tekrarlanabilir sonuçlar için gürültü oranı yüksek sinyal seçilir ve klasik oldu. Ayrıca, homologları ABC taşıyıcıları olarak önemli negatif kontroller hizmet etmek vardır. taşıyıcı, ModBC (ligant A) deterjan saflaştırılmış ve çip üzerinde hareketsiz kılınmış kullanılarak membran elde edilir. Onun çözünebilir etkileşim ortağı, Moda, analit olduğunu. Negatif kontrol ligand olarak, farklı bir ABC transportör RbsBC ("bağ B") kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
SPR moleküler etkileşimleri incelemek için son derece hassas bir yöntemdir ve geçici (henüz önemli) etkileşimlerin gerçek zamanlı izleme sağlar tek yaklaşım genellikle. Bir örnek başka bir yöntemle (açılan deneyleri, lipozomlar sedimantasyon tahlilleri 6) tarafından tespit edilememiştir burada sunulan geçici etkileşim vardır. Diğer yöntemler (nicel veya nitel olsun) ölçümleri denge sınırlıdır Dahası, SPR da ön denge kinetiği ölçmek tek tekniklerden biridir.
<p class="j…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research at the Lewinson lab is supported by grants from the Israel Academy of Science, the Rappaport Institute for Biomedical research, the Meriuex Research Foundation, and the Marie Curie career reintegration grant (OL). EV is supported by the Fine scholarship and by the Technion Faculty of Medicine. NLL is supported by grants from the Israel Academy of Science.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007–47——N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. i. g. h. e. r. -. t. h. r. o. u. g. h. p. u. t. label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E., Mol, N. J., Fischer, M. J. E. . Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. 1, 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. . Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
