في الوقت الحقيقي السمسة فحوصات في الدم الكامل بالبشر
Summary
كامل فحص السمية الخلوية الدم (التعداد الزراعي العالمي) هو فحص السمية الخلوية المتقدمة من خلال دمج الإنتاجية العالية تكنولوجيا تحديد المواقع المحمولة مع المجهري مضان ومعالجة الصور الآلي. هنا، نحن تصف كيفية التعامل مع خلايا سرطان الغدد الليمفاوية الأجسام المضادة مكافحة CD20 يمكن تحليلها في الوقت الحقيقي في الدم البشري كله لتوفير التحليل الكمي السمسة الخلوية.
Abstract
ووضعت على أساس الخلايا الحية فحص الدم الكامل السمية الخلوية (التعداد الزراعي العالمي) التي تتيح الوصول إلى المعلومات الزمنية من السمية لخلايا الكلية مع الإنتاجية العالية تكنولوجيا تحديد المواقع الخلية. ومبرمجة السكان الخلايا السرطانية المستهدفة أول من الشلل في شكل مجموعة، وصفت مع الأخضر الأصباغ الفلورية عصاري خلوي. بعد تشكيل مجموعة خلايا، يتم إضافة أدوية الأجسام المضادة في تركيبة مع الدم البشري كله. ثم يضاف يوديد propidium (PI) لتقييم موت الخلايا. ويتم تحليل مجموعة الخلايا مع نظام التصوير التلقائي. بينما الصبغة عصاري خلوي تسميات السكان الخلايا السرطانية المستهدفة، PI تصف السكان الخلايا السرطانية الميتة. وبالتالي، فإن النسبة المئوية للقتل الخلايا السرطانية المستهدفة يمكن كميا عن طريق حساب عدد الخلايا المستهدفة على قيد الحياة إلى عدد من الخلايا الميتة المستهدفة. مع هذا الأسلوب، والباحثين قادرون على الوصول تعتمد على الوقت والمعلومات السمية لخلايا تعتمد على الجرعة. بشكل ملحوظ، لا راديو الخطرةوتستخدم المواد الكيميائية. في التعداد الزراعي العالمي المعروضة هنا تم اختبارها مع سرطان الغدد الليمفاوية وسرطان الدم، وخطوط الخلايا السرطانية الصلبة. لذا، WCA يسمح للباحثين لتقييم نجاعة الأدوية في حالة شديدة الصلة خارج الحي.
Introduction
وقد أدت التطورات الحديثة في الصناعة الدوائية لزيادة الاهتمام في تحقيق هويات معينة من الأجسام المضادة الخلايا السرطانية وعلاج السرطان شخصية. ومع ذلك، واجه عدة عقبات في هذه العملية. مرخصة 5٪ فقط من العوامل التي لها نشاط مضاد للسرطان في التنمية قبل السريرية بعد تبين فعالية كافية في المرحلة II-III 1،2 الاختبار. الاستراتيجيات قبل السريرية (سواء في التجارب المختبرية والحية) غير كافية كما أظهرت العديد من الأمثلة التي المخدرات انتيتومور تتصرف بشكل مختلف في البشر والحيوانات في المختبر يرجع ذلك أساسا إلى مكوناتها الدم المختلفة 3-5.
لمعالجة ضرورة منصة فحص المخدرات انتيتومور وتوفير نقطة تفتيش قبل التجارب على الحيوانات مكلفة والتجارب السريرية، يقترح كله فحص السمية الخلوية الدم البشري (التعداد الزراعي العالمي) لتقييم فعالية الدواء المضاد للورم في بيئة أكثر البيولوجية ذات الصلة. الفحص الدم كله سمية الخلايا يمكن استخدامها لتقييم مدى استجابة الخلايا الفردية إلى الأجسام المضادة ومرشحين آخرين في المخدرات الدم البشري كله.
يتم تطوير التعداد الزراعي العالمي من خلال دمج التكنولوجيا العالية الإنتاجية تحديد المواقع المحمولة مع الإنتاجية العالية وارتفاع محتوى التصوير 6. من خلال الاستفادة من نظام التصوير الآلي، ويمكن تحديد عدد الخلايا الحية والميتة على حد سواء مع وجود درجة عالية من الدقة. يرجع ذلك إلى حقيقة أن الخلايا المستهدفة وثبتوا على نفس المستوى البؤري، التعداد الزراعي العالمي قادر على تقديم تحليل السمية الخلوية الكمي في الوقت الحقيقي دون ازالة خلايا الدم الحمراء. وعلاوة على ذلك، فإن نظام التصوير التلقائي يوفر العديد من المزايا مثل أن الخلايا المستهدفة الوحيدة التي وصلت إلى معايير محددة (على سبيل المثال، خلايا fluorescently المسمى، ومورفولوجيا الخلية) هي بوابات ومعالجتها. أيضا، فإنه يتيح إنتاج 144 لوحات في اليوم الواحد. وبالتالي، هذه القدرة الإنتاجية التصوير وتتيح تشغيل عالية ج-ontent والتجارب الإنتاجية العالية في وقت واحد. من خلال الجمع بين التعداد الزراعي العالمي ونظام التصوير الآلي، ويمكن تحقيق إنتاجية عالية السمية لخلايا التحليل الكمي في بيئة أكثر البيولوجية ذات الصلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
التعداد الزراعي العالمي هو حاسم في المختبر المضادة للسرطان أداة فحص مع قرار خلية واحدة 12-16، الاستفادة بشكل مثالي بعد الهدف العروض التقليدية مثل CDC والمقايسات ADCC 9-11، وقبل الاختبارات قبل السريرية الحيوانية. حاليا، الهدف الأساسي فحوصات مثل فحص CDC أو ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر برنامج IMAT المعهد الوطني للسرطان من المعاهد الوطنية للصحة تمويل هذا العمل [R33 CA174616-01A1].
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Name/Discription |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
- Hutchinson, L., Kirk, R. High drug attrition rates–where are we going wrong. Nat Rev Clin Oncol. 8, 189-1890 (2011).
- Moreno, L., Pearson, A. D. Attrition rates be reduced in cancer drug discovery. Informa healthcare. 8, 363-368 (2013).
- Seok, J., et al. Inflammation and Host Response to Injury, Large Scale Collaborative Research Program. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3507-3512 (2013).
- Suntharalingam, G., et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. N Engl J Med. 355, 1018-1028 (2006).
- Eastwood, D., et al. Monoclonal antibody TGN1412 trial failure explained by species differences in CD28 expression on CD4+ effector memory T-cells. Br J Pharmacol. 161, 512-526 (2010).
- Hsiao, S. C., Liu, H., Holstlaw, T. A., Liu, C., Francis, C. Y., Francis, M. B. Real time assays for quantifying cytotoxicity with single cell resolution. PLoS One. 8, 10-1371 (2013).
- Wang, S. Y., Weiner, G. Rituximab: a review of its use in non-Hodgkin’s lymphoma and chronic lymphocytic leukemia. Expert Opin Biol Ther. 8, (2008).
- Dalle, S., Thieblemont, C., Thomas, L., Dumontet, C. Monoclonal antibodies in clinical oncology. Anticancer Agents Med Chem. 8, 523-532 (2008).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64, (1983).
- Gerlier, D., Thomasset, N. J. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activation. Immunol Methods. 94, 57-63 (1986).
- Toriello, N. M., et al. Integrated microfluidic bioprocessor for single-cell gene expression analysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (2008).
- Douglas, E. S., Hsiao, S. C., Onoe, H., Bertozzi, C. R., Francis, M. B., Mathies, R. A. DNA-barcode directed capture and electrochemical metabolic analysis of single mammalian cells on a microelectrode array. Lab on a Chip. 9, 2010-2015 (2008).
- Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Current opinion in pharmacology. 9, 580 (2009).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends in Biotechnology. 28, 237-245 (2010).
- Coelho, J., P, L., Quinn, S., Murphy, R. F. Automated image analysis for high-content screening and analysis. J Biomol Screen. 15, 726-734 (2010).
- Sundberg, S. A. High-throughput and ultra-high-throughput screening: solution- and cell-based approaches. Current Opinion in Biotechnology. 11, 47 (2000).
- Simmons, L. A. Personalized medicine is more than genomic medicine: confusion over terminology impedes progress towards personalized healthcare. PERS MED. 9, 85 (2012).
