En tiempo real Ensayos de citotoxicidad en sangre entera humana
Summary
El ensayo de citotoxicidad de sangre entera (WCA) es un ensayo de citotoxicidad desarrollado mediante la incorporación de alto rendimiento de la tecnología de posicionamiento celular con microscopía de fluorescencia y de procesamiento de imágenes automatizado. Aquí se describe cómo las células de linfoma tratados con un anticuerpo anti-CD20 se pueden analizar en tiempo real en toda la sangre humana para proporcionar un análisis de citotoxicidad celular cuantitativa.
Abstract
A sangre entera citotoxicidad ensayo basado en células en vivo (WCA) que permite el acceso a la información temporal de la citotoxicidad de las células en general se desarrolla con alto rendimiento de la tecnología de posicionamiento celular. Las poblaciones de células tumorales están dirigidas en primer lugar a la inmovilización preprogramados en un formato de matriz, y se marcaron con tintes verdes citosólicas fluorescentes. Después de la formación de conjunto de células, se añaden fármacos de anticuerpos en combinación con sangre humana entera. A continuación se añade yoduro de propidio (PI) para evaluar la muerte celular. El conjunto de células se analizaron con un sistema de imagen automático. Mientras tinte citosólica etiquetas de las poblaciones de células tumorales específicas, PI etiquetas de las poblaciones de células tumorales muertas. Por lo tanto, el porcentaje de muerte de células cancerosas diana se puede cuantificar mediante el cálculo del número de células supervivientes dirigidas al número de células diana muertas. Con este método, los investigadores son capaces de acceder dependiente del tiempo y la información de la citotoxicidad celular dependiente de la dosis. Sorprendentemente, ni radio peligrososse utilizan productos químicos. El WCA que aquí se presenta ha sido probado con el linfoma, la leucemia, y las líneas celulares de tumores sólidos. Por lo tanto, WCA permite a los investigadores para evaluar la eficacia del fármaco en una condición muy relevante ex vivo.
Introduction
Los avances recientes en la industria farmacéutica han llevado a un mayor interés en la realización de las identificaciones específicas de anticuerpos de células tumorales y los tratamientos de cáncer personalizadas; sin embargo, varios obstáculos se encuentran en el proceso. Sólo el 5% de los agentes que tienen actividad contra el cáncer en fase de desarrollo preclínico tienen licencia después de mostrar eficacia suficiente en fase de prueba II-III 1,2. Las estrategias preclínicos (tanto in vitro como in vivo) son subóptimas como muchos ejemplos han demostrado que los fármacos antitumorales comportan de manera diferente en humanos y en animales de laboratorio, principalmente debido a sus diferentes componentes de la sangre 3-5.
Para hacer frente a la necesidad de una plataforma de cribado de fármacos antitumorales y para proporcionar un punto de control antes de los experimentos costosa animales y ensayos clínicos, se propone un ensayo de citotoxicidad de sangre entera humana (WCA) para evaluar la eficacia del fármaco antitumoral en un entorno biológico más relevante. Laensayo de citotoxicidad de sangre entera se puede utilizar para evaluar la respuesta de las células individuales a los anticuerpos y otros candidatos a fármacos en sangre completa humana.
El WCA es desarrollado por la incorporación de la tecnología de alto rendimiento de posicionamiento celular con alto rendimiento y alto contenido de imágenes 6. Mediante la utilización de un sistema de imagen automático, el número de ambas células vivas y muertas se puede determinar con un alto grado de precisión. Debido al hecho de que las células diana se inmovilizan en el mismo plano focal, WCA es capaz de proporcionar análisis de citotoxicidad cuantitativa en tiempo real sin la eliminación de las células rojas de la sangre. Por otra parte, el sistema de imagen automática ofrece varias ventajas, tales como que sólo las células diana que han alcanzado los criterios especificados (por ejemplo., Células marcadas con fluorescencia, y la morfología celular) están cerradas y procesados. Además, permite la producción de 144 placas por día. En consecuencia, esta capacidad de imagen y rendimiento permite correr de alta contenido y experimentos de alto rendimiento al mismo tiempo. Mediante la combinación de WCA y el sistema de formación de imágenes automatizado, de alto rendimiento análisis de la citotoxicidad de células cuantitativa puede lograrse en un entorno más biológica relevante.
Protocol
Representative Results
Discussion
WCA es una crítica en herramienta de detección anti-cáncer vitro con células sola resolución 12/16, idealmente utilizado después de exámenes objetivos tradicionales, como los CDC y ensayos de ADCC 11.09, y antes de los ensayos con animales preclínicos. Actualmente, los ensayos de cribado diana primaria tales como CDC o ensayos de ADCC se llevan a cabo todos en un medio simplificados o un sistema tampón. Sin embargo, los fármacos candidatos que muestran eficacia en estos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos programa IMAT Instituto Nacional del Cáncer del NIH para la financiación de este trabajo [R33 CA174616-01A1].
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Name/Discription |
| Cell attachment 96 well plate kits | Adheren | AP9601 | |
| Suspension Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0801 | |
| Adherent Single cell array 8 well chamber slide | Adheren | SS0802 | |
| Lymphoma cell line CD20+ | ATCC | CCL-86 | Raji cells |
| Lymphoma cell line CD20- | ATCC | CRL-8083 | MC/CAR |
| RPMI 1640 with L-glutamine | Life Technologies | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo | SH30070.01HI | |
| Peni/Strep | Life Technologies | 15070063 | |
| Cytosolic dye | Life Technologies | C7025 | Cell Tracker Green |
| Rituxan (Biosimilar) | Eureka Therapeutics | ||
| Human whole blood | Allcells | WB001 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | |
| Automatic imaging system | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
| Cell counting program | Molecular Devices | Contact Vendor | Cell Reporter |
References
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