Membro Remoto Pré-Condicionamento Isquêmico: A Técnica neuroprotetor em roedores

Summary

Pré-condicionamento isquémico remoto (RIP) é um método de tecidos condicionado contra o stress prejudicial. Nós estabelecemos um método de isquemia remoto no membro posterior, inflando um manguito de esfigmomanômetro para 5-10 min. As capacidades neuroprotectoras de PIR foi demonstrada num modelo de degeneração da retina em roedores.

Abstract

Isquemia subletal protege os tecidos contra subsequente isquemia, mais severa a regulação positiva através de mecanismos endógenos no tecido afectado. Isquemia subletal também tem sido demonstrado que regulam positivamente os mecanismos de protecção nos tecidos remotos. Um breve período de isquemia (5-10 min) na pata traseira dos mamíferos induz respostas de auto-proteção no cérebro, pulmão, coração e retina. O efeito é conhecido por pré-condicionamento isquémico remoto (PIR). É uma maneira terapeuticamente promissora de proteger os órgãos vitais, e já está em fase de testes clínicos para o coração e cérebro lesões. Esta publicação mostra, um método minimamente invasivo controlada de fazer um galho – especificamente o membro posterior de um rato – isquêmica. Um medidor de pressão desenvolvido para uso em recém-nascidos humanos está ligado a um medidor de tensão manual e usado para aplicar pressão de 160 mmHg, em torno da parte superior do membro posterior. Uma sonda concebida para detectar a temperatura da pele é utilizado para verificar a ischemium, por registo da queda de temperatura da pele causado pela oclusão induzida por pressão das artérias das pernas, e o aumento da temperatura que segue libertação da braçadeira. Este método de RIP proporciona proteção a retina de ratos contra brilhante dano induzido por luz e degeneração.

Introduction

A sobrevivência da maior parte, talvez todos, os tecidos do rosto de stress metabólico podem ser melhoradas por condicionamento prévio com um período de isquemia subletal ^1,2. Pré-condicionamento isquêmico (IP), em termos práticos é a exposição dos tecidos à isquemia sub-letal, antes de as experiências de tecido estressores mais graves, como um insulto isquêmico subseqüente. Em modelos animais, IP fornece protecção notável para o cérebro, retina, coração e pulmões ^3-6. Do mesmo modo, observações em pacientes com AVC mostrou uma ligação entre os ataques isquêmicos transitórios anteriores e melhores resultados clínicos ^7,8. IP também protege fotorreceptores da retina de lesões não-isquêmica ^9.

A eficácia de IP em diversos tecidos e lesões sugere que está a activar um mecanismo inato de sobrevivência de células presente em todo o tecido. Pré-condicionamento isquémico do miocárdio foi sugerido ter efeitos protectores, através da regulação positivado factor de hipóxia indutível (HIF), conhecido para regular muitos processos metabólicos através da libertação de adenosina ou através da abertura de canais de potássio ATP mitocondriais ^10,11. Canais de liberação de adenosina e ATP potássio estão envolvidos na isquemia cerebral, mas, as investigações sobre os mecanismos neuroprotectores de condicionamento isquêmico até à data têm sido focados na modificações anti-excitotoxicity, vias anti-apoptóticos e anti-inflamatórios ^12,13. Em geral, a compreensão do processo molecular de condicionamento isquémico para protecção dos neurónios é limitada.

Tentativas de pré-condicionamento isquêmico remoto para condicionar órgãos distantes criticamente importantes (coração, cérebro, pulmão), gerando isquemia em tecidos menos críticas. Pré-condicionamento isquémico remoto (RIP), usando o membro posterior foi demonstrado ser neuroprotectores, em modelos de roedores de acidente vascular cerebral ^14-17. O método descrito por nós proporciona um prot simples, fiável e não-invasivaOCOL para induzir PIR.

A grande maioria dos protocolos RIP envolvem o membro posterior, presumivelmente porque a artéria femoral localizado no membro posterior superior pode ser facilmente identificado e o acesso para fixação cirúrgica e aplicação torniquete. Em estudos de isquemia dos membros invasivo para o estudo do cérebro e de protecção da pele, isquemia é induzida através da separação da artéria femoral dos ligamentos na virilha e aperto da artéria femoral ^2,15,18.

A isquemia resultante do aperto ou da artéria femoral ou cuffing membro foi confirmada por alterações no membro, incluindo uma perda de pulso, diminuição da oxigenação e uma queda na temperatura da pele. Isquemia remoto pode ser confirmada pela perda de pulso através da utilização de Doppler a laser ou ultra-som Doppler ^17-19. A temperatura da pele pode ser utilizada como alternativa ao Doppler embora a relação não é linear ^20,21. Gravações de temperatura precisas são comuns em laboratórios e lataser facilmente incorporado em estudos isquémicos remotos.

Uma alternativa para a fixação femoral cirurgia é a indução de isquemia através de um torniquete. Garroteamento produz isquemia comparável ao obtido com pinçamento navio; Kutchner et ai. em comparação artéria femoral invasivo de aperto para um torniquete não-invasivo e encontrou os dois métodos interrompido o fluxo de sangue para o membro e reduziu os danos da pele em um modelo de cirurgia plástica de retalho de pele isquemia ^18. Cuffing ou a perna ou o braço e aumentar a pressão da braçadeira para acima da pressão arterial sistólica foi encontrada para ser protetor contra o dano isquêmico em suínos e humanos ^17,19,22.

Torniquete diferentes abordagens para induzir remoto isquêmico incluem o uso de um manguito de pressão arterial ou um ^17,22,23 elástico. No entanto, o uso de uma faixa elástica para induzir isquemia é um método inseguro, potencialmente dar origem a uma quantidade não regulada de pressão nomembro, com aumentos de pressão acima de 500 mmHg a ser gravado em humanos ^24. Além disso, a isquemia do membro utilizando uma banda elástica conduz a lesão muscular em ratos, após a remoção da banda ^23, como avaliado por Evans Blue Dye, um marcador in vivo de células musculares permeabilidade ^25. Em contraste, a entrega de uma pressão controlada para o torniquete pode ser conseguido usando um medidor de pressão ligado a um ^17,19,22,26 esfigmomanómetro.

Neste estudo, um modelo de lesão de luz de degeneração de fotorreceptores foi usada para demonstrar a eficácia neuroprotectora de pré-condicionamento isquémico remoto. Remoto isquemia foi induzida imediatamente antes da lesão luz, e impediu subsequente degeneração de fotorreceptores como confirmado por testes de função da retina. O vídeo que acompanha irá demonstrar a aplicação de isquemia remoto não-invasiva.

Protocol

Declaração de ética: O protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais de University of Sydney, AEC # 5657. A anestesia foi aprovado pelo comitê de ética animal (Universidade de Sydney, AEC # 5657). 1. Equipamentos Preparação Use rastreamento em tempo real temperatura da pele. Ligue computador e hardware de aquisição de dados. Software de gravação de temperatura aberto e ajustar ajuste de temperatura a entre 30-35 ° C e a frequência da amostragem para c…

Representative Results

Um manguito de pressão arterial elevada para acima de 160 mmHg interrompe o fluxo sanguíneo para o membro posterior como pode ser visto claramente na Figura 1B. A falta de oxigenação do tecido resultou numa redução da temperatura do pé do animal por um protocolo de isquemia-reperfusão (Figura 2). A temperatura do pé (33 ° C) foi menor do que a temperatura do núcleo e reduzida de forma fiável durante a elevação da pressão do balonete (31 ° C), aumentando quando a braçade…

Discussion

Roedor membro posterior isquemia foi induzida com sucesso com um esfigmomanômetro e algemá entregar neuroproteção para os fotorreceptores da retina. Um achado consistente com o condicionamento induzido proteção isquêmico de fotorreceptores de uma lesão leve ^9,28.

Essencialmente, isquemia remoto faz com que a privação breve oxigênio aos tecidos. Assim, o pré-condicionamento isquémico remoto tem muitas semelhanças com o condicionamento isquémico ou alternativamente de…

Materials

Gold series DuraShock Hand Aneroid Sphygmomanometer	Welch Allyn	DS56	Manual Sphygmomanometer
Neonate [size 2] 1 Tube, 10 Pack	Welch Allyn	5082-102-1	Limb blood pressure cuff
Luer lock adaptor	Welch Allyn	5082-178	Adaptor for neonatal cuff
Thermistor pod	AD Instruments	ML 309	skin tempertature unit
Skin temperture probe	AD Instruments	MLT 422/A
Powerlab, 4 channel acquistion hardware	AD Instruments	PL 35044	Skin temperature recorder
Homeothermic blanket system with flexible probe	Harvard Appartus	507222F
Towel			optional: awake remote ischemia
Isoflo – 100% Isoflurane -250 ml	Abbot Animal Health	05260-05	optional: inhaltion anaesthetic remote ischemia
Ketamil – ketamine 100 mg/ml – 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		optional: injectable anaesthetic remote ischemia
Xylium – Xylazine 100 mg/ml – 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		optional: injectable anaesthetic remote ischemia