Oppervlakte Potentieel Meting van Bacteriën Met behulp Kelvin Probe Force Microscopy

Summary

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Abstract

Oppervlaktepotentiaal is een algemeen uitzicht fysieke eigenschap dat een dominante rol in de hechting van micro-organismen aan substraatoppervlakken speelt. Kelvin sonde kracht microscopie (KPFM) is een module van atomic force microscopie (AFM) dat het contact potentiaalverschil tussen oppervlakken op nano-schaal meet. De combinatie van KPFM AFM maakt gelijktijdige opwekking van oppervlaktepotentiaal en topografische kaarten van biologische monsters zoals bacteriële cellen. Hier maken we KPFM de effecten van de oppervlakte potentiaal op microbiële hechting op medisch relevante oppervlakken zoals roestvrij staal en goud onderzoeken. Oppervlakte potentiaalkaarten geopenbaard verschillen in oppervlaktepotentiaal microbiële membranen van verschillende materialen substraten. Een stap hoogte grafiek werd gegenereerd om het verschil in oppervlaktepotentiaal show in een grensgebied tussen het substraatoppervlak en micro-organismen. Veranderingen in cellulaire membraan oppervlaktepotentiaal zijn verbonden met overstaps in cellulaire metabolisme en motiliteit. Daarom KPFM is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om de veranderingen van microbiële membraanoppervlak potentieel bij hechting op diverse substraatoppervlakken onderzoeken. In deze studie demonstreren we de procedure voor de oppervlaktepotentiaal van individuele methicilline-resistente Staphylococcus aureus USA100 cellen te karakteriseren op roestvrij staal en goud met KPFM.

Introduction

Biofilms geproduceerd op apparatuur oppervlakken en in huidwonden een probleem vormen voor de medische industrie als biofilms zijn recalcitrant te verwijderen en kan leiden tot een verhoogde tarieven van de overdracht van ziekten en antimicrobiële resistentie. Hechting is de eerste stap in biofilmvorming en is de meest kritische stap vanwege de omkeerbaarheid ^1-3. Substraat oppervlakte-eigenschappen spelen een cruciale rol op de microbiële gehechtheid. Factoren zoals oppervlakte hardheid, porositeit, ruwheid en hydrofobiciteit is aangetoond dat bacteriële hechting te bewerkstelligen; Er is echter weinig onderzoek naar de invloed van substraatoppervlak potentiaal (SP) op microbiële adhesie gedaan ^4,5. Negatief geladen oppervlakken te voorkomen de bevestiging van Bacillus thuringiensis sporen mica, silicium, goud en ^6. Veranderingen in cellulaire membraanpotentiaal wijzen op veranderingen in cellulaire hechting en motiliteit ^5,7. Het is waargenomen dat elektrisch homogeneous oppervlak te bevorderen microbiële adhesie ^5. Karakterisering van de oppervlaktepotentiaal van bacteriën op nanoschaal kan een nieuwe manier om de hechting kinetiek van bacteriën voor verschillende ondergronden begrijpen verschaffen, en daardoor kan helpen bij de ontwikkeling van anti-biofouling strategieën. In tegenstelling tot andere methoden voor het karakteriseren van de electro kinetiek bacteriën zoals elektroforetische lichtverstrooiing, zeta potentiaal en isoelektrisch punt bepalen, Kelvin probe force microscopie (KPFM) maakt het onderzoek van individuele cellen in plaats van gehele kweken ^8-11. Dit is gunstig wanneer willen vergelijken cel-cel of biofilm elektrische kenmerken met een hoge nauwkeurigheid en precisie.

KPFM is een module van atomaire kracht microscopie (AFM). AFM werd ontwikkeld als een direct gevolg van de scanning tunneling microscoop (STM) ^12. De eerste gepubliceerde beelden met behulp van STM werden gedaan door Gerd Binnig en Heinrich Rorhrer in 1982 ¹² </sup>. Hun uitvinding was in staat om atoomstructuren lossen door Rasterscanning een scherpe geleidende tip over een geleidend oppervlak in de lucht. De implicaties van het bereiken van een hoge-resolutie beelden opgewonden biologen die snel geprobeerd om STM gebruiken om het beeld gedroogde monsters van DNA, eiwitten en virussen ^12. STM kan ook in vloeistoffen met gespecialiseerde meetpennen ^13. Dit werd aangetoond door Lindsay et al., Die STM en AFM gebruikt om beelden DNA moleculen in 10 mM HClO ₄ en water, op goud elektroden ^13. KPFM is aangetoond in het bepalen van de oppervlaktepotentiaal van DNA en eiwitanalyse ²⁵ en biomoleculen interactie met liganden ^26.

KPFM werkt door het meten van het contact potentiaalverschil (CPD) tussen een AFM geleidende cantilever tip en een ideaal geleidende monster (Figuur 1, i) ^14,15. Monsters niet noodzakelijkerwijs geleidende (dwz biologische Sampl zijnes). Imaging kan op mica, glas en silicium oppervlakken (niet geleidend), zolang de niet-geleidende oppervlak dun en er een onderliggend geleidend materiaal ^6,7 uitgevoerd. De CPD is gelijk aan de oppervlaktepotentiaal spanning en kan worden omschreven als het verschil in de werkfuncties tussen de tip (φ _tip) en monster (φ _monster), gedeeld door de negatieve elektron lading (- e). Wanneer een geleidende AFM tip dicht wordt gebracht op een monsteroppervlak (gescheiden door afstand d), een elektrostatische kracht (F _n) gegenereerd door het verschil in Fermi energie (Figuur 1, ii, a) ^15. Op dit punt, het vacuüm energieën van de tip en monster (E _v) in evenwicht en uitgelijnd. Bij het ​​brengen van de punt dichter bij het ​​monster oppervlak, de tip en sample oppervlak in elektrisch contact en fungeren als parallelle plaat condensatoren (Figuur 1, ii, b komen </strong>) ^14,15. Op het moment, de Fermi energie van de tip en monsteroppervlak gelijkgericht raken, tot een steady-state-evenwicht (figuur 1, ii, b). De tip en sample oppervlak wordt in rekening gebracht en een V _CPD zal vormen als gevolg van een verschil in E _v 's en werkfuncties. Acts Een F _es op het elektrisch contact gebied als gevolg van de gevormde V _CPD. Deze kracht wordt vervolgens vernietigd door toepassing van een externe V _DC aan de tip die dezelfde grootte als de gevormde V _CPD heeft (figuur 1, ii, c). Dit gold gelijkspanning elimineert oppervlaktelading op het gebied van elektrisch contact, en de hoeveelheid V _DC noodzakelijk de F _es V _CPD elimineren is gelijk aan het verschil in de werkfuncties tussen de sample oppervlak en tip ^15. Opgemerkt zij dat de werkfunctie van de tip is bekend en wordt geleverd door de fabrikanten. In alle KPFM werkwijzen, een AC spanning (V _AC, ongeveer 100-500 mV) wordt ook toegepast op de tip om oscillerende elektrische kracht tussen de tip en monster ¹⁴ genereren. Dit zorgt voor een betere resolutie bij het ​​meten van veranderingen in de V _CPD en / of F _es. In dit opzicht kunnen veranderingen in de frequentie of amplitude van de elektrische oscillatie worden gecorrigeerd door V _DC en oppervlakte potentiaalkaarten kunnen worden gegenereerd. Gegevens van specifieke gebieden van deze kaarten kan verder worden geanalyseerd om de elektrische informatie over specifieke topografische kenmerken bieden.

KPFM kan in drie modi: (1) lift stand (2) amplitudemodulatie (AM) modus, en (3) frequentiemodulatie (FM) modus ^14,16. Lift-modus was de eerste incarnation van KPFM. Lift-modus is gebaseerd op een twee-pass-methode waarbij een kronkelende tip wordt gesleept over het oppervlak om een ​​topografische afbeelding te verkrijgen. Voor de tweede pas het topje omhoog staat een vooraf ingestelde afstand boven het monster (10-100 nm) en terug over hetzelfde gebied gescand. Door deze twee-pass-methode, lift-modus, in vergelijking met AM- en FM-KPFM, neemt de langste tijd voor het acquisitie. Het verhogen van de tip van het oppervlak zorgt ervoor dat alleen lange afstand F _es gemeten. Ook wordt overspraak tussen topografie en oppervlaktepotentiaal metingen ontkoppeld ten koste van toegenomen laterale resolutie en gevoeligheid.

AM-KPFM verbetert de laterale resolutie en gevoeligheid door het gebruik van dual-frequenties voor het gelijktijdig meten monster topografie en oppervlaktepotentiaal (one-pass scan) ^14. In de AM-modus, wordt de cantilever mechanisch schommelde, in het algemeen 5% onder het eerste resonantiefrequentie (f _0), en elektrisch schommelde (through een V _AC) bij zijn tweede resonantiefrequentie (f _1). Veranderingen in de amplitude van f ₀ leidt tot het genereren van topografische gegevens, terwijl veranderingen in de amplitude van _f1, door veranderingen in F _es en V _CPD geven oppervlaktepotentiaalmeter meetgegevens. f ₀ en f ₁ van de cantilever gescheiden door belangrijke frequenties en energieën signaal overspraak geminimaliseerd ^14. Het hoofd elektronica doos (HEB) van de AFM scheidt de twee signalen om zowel topografische geven en oppervlakte potentiële gegevens tegelijkertijd in één scan. FM-KPFM verbetert de resolutie nog verder dan het AM-KPFM op biologische oppervlakken ^14. FM-KPFM werkt anders dan de AM-KPFM in dat het meet de ontwikkeling van elektrostatische kracht hellingen in plaats van elektrostatische kracht (F _n) ^15. Net als de AM-modus, FM-modus maakt gebruik van dual-frequenties en formae bypass aftastmechanisme verkrijgen topografische en oppervlaktepotentiaal gegevens tegelijk ^14. In de FM-modus wordt de cantilever mechanisch schommelde bij f ₀ en elektrisch schommelde bij een lage gewijzigde frequentie (f _mod, meestal 1-5 kHz). Bij elektrostatische interacties, f ₀ en f _mod mix te zijbanden f ₀ ± f _mod te produceren. De zijbanden zijn zeer gevoelig voor elektrostatische kracht, en kan uit f ₀ gescheiden door AFM HEB. Aangezien FM-KPFM meet de ontwikkeling van elektrostatische kracht hellingen, de tips apex vorm en het onderhoud / integriteit spelen een cruciale rol in de totale oppervlakte potentieel resolutie ^{14, 15.} Oppervlaktepotentiaal resolutie met behulp van AM en FM-modi zijn in het bereik van 1 nm zijwaarts ^{14 -16.} Opgemerkt zij dat KPFM beeldvorming kan worden uitgevoerd in niet-polaire vloeistoffen, en meer recent is aangetoond worden gedaan low-ionische (<10 mM) polaire vloeistoffen (inopen lus KPFM modes die geen vertekening terugkoppeling vereisen, waardoor het niet toepassen van een DC-bias) zoals MilliQ water; echter KPFM beeldvorming nog gebeuren op levende cellen in polaire oplossingen ^17-20. Extra uitdagingen van SP beeldvorming vloeistof die oplossingen gebruikt voor het handhaven cellen (bijvoorbeeld, fosfaat gebufferde zoutoplossing) hebben hoge concentraties van mobiele ionen, hetgeen leidt tot Faraday reacties, diagonaal-geïnduceerde lading dynamiek en ionendiffusie / herverdeling ^20. Zo dit experiment werden metingen genomen van gedroogd en MRSA dode cellen op poly-L-lysine gefunctionaliseerde roestvrij staal en goud oppervlakken onder omgevingsomstandigheden. Beeldvorming kan plaatsvinden onder omstandigheden lucht of vacuüm worden uitgevoerd op biologische monsters die eerder zijn gedroogd of geïmmobiliseerd op oppervlakken ^20. Vochtige omstandigheden hebben ook aangetoond KPFM beeldvorming oppervlakken ⁶ beïnvloeden.

In deze studie hebben we gebruikt FM-KPFMAFM en de rol van SP op de bevestiging van methicilline-resistente Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) poly-L-lysine gefunctionaliseerde roestvrij staal en goud oppervlakken onderzoeken. MRSA is onlangs oogstte status als een multi-resistente (MDR) "superbacterie" vanwege zijn natuurlijke geselecteerde bestendigheid tegen vele β-lactam antibiotica en cefalosporinen ^21. MRSA infecties zijn nu moeilijker, moeilijker en formidabele te behandelen, waardoor het gebruik van hardere antibiotica zoals vancomycine en oxazolidinonen die hogere toxiciteit bij mensen hebben, en daarom niet als langdurige behandeling ^22. Roestvrij staal werd gekozen vanwege zijn medisch belang en gemeenschappelijk gebruik als materiaal in injectienaalden, ondersteken, deurkrukken, putten, enz goud werd gebruikt als vergelijkende metaal. FM-KPFM werd gebruikt om te onderzoeken of microbiële membraan SP veranderingen na bevestiging aan de substraten.

Protocol

1. Voorbereiding van glaswerk en Culturen Voordat u verder gaat met dit experiment, voor te bereiden 5% schapenwol bloed agar (SBA) platen voor het kweken van MRSA. Incubeer SBA platen gedurende 24 uur bij 37 ° C. Hierna moeten centrale, goed geïsoleerde kolonies aanwezig gebruiken voor daaropvolgende entingen in vloeibare media. WINKEL strepen SBA platen met afzonderlijke kolonies bij 4 ° C gedurende 1-2 maanden. OPMERKING: Schapen agarplaten komen voorgevormde verpakkingen tussen 20-25 platen op b…

Representative Results

De mogelijkheid om SP meten met KPFM berust op het beginsel dat zowel het monsteroppervlak en cantilever tip geleidend enigszins. Roestvrij staal en goud gehandeld als geleidende oppervlakken waarop MRSA werden vastgemaakt. KPFM beelden werden genomen van 15 MRSA-cellen op beide oppervlakken met 512 x 512 resolutie, en met scan gebieden, variërend van 5 x 5 micrometer tot 10 x 10 micrometer. Scanning werd uitgevoerd met lijn snelheden variërend van 0,02 lijnen / sec tot 0,05 lijnen / sec. Daarom, met 512 datapunten ve…

Discussion

KPFM werd gebruikt als een nieuwe techniek voor het verkrijgen van elektrische oppervlakteweerstand gegevens. Het is algemeen gebruikt als een methode voor de behandeling ladingsverdeling chemie en is pas sinds kort worden voor de studie van biologische systemen micro- en nano-schaal. Uit de verzamelde gegevens bleek dat microben leek niet gemakkelijk hechten aan roestvrij staal en goud reinigen oppervlakken, zelfs na 3 uur van statische incubatie. Poly-L-lysine gefunctionaliseerde oppervlakken liet snelle microbiële h…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
5500ILM Atomic Force Microscope	Agilent Technologies	#N9435S
AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16219	Stainless steel sample discs
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes	Mikromasch	#HQ:DPE-XSC11	There are 4 Pt-coated cantilevers per chip.  We utilized cantilever B for experiments.
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs	TED PELLA, INC.	#16218-G	Gold sample discs
PicoView Software	Agilent Technologies	#N9797B	5500ILM Atomic Force Microscope imaging software
Pico Image Software (Pico Image Basic)	Agilent Technologies	#N9797AU-1FP	5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge	Thomas Scientific	#91201513	Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BD	#221261	Pre-made plates
Tryptic Soy Broth	BD	#257107	Comes as a dry powder.  Instruction on how to make come on the container.