Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.
Oppervlaktepotentiaal is een algemeen uitzicht fysieke eigenschap dat een dominante rol in de hechting van micro-organismen aan substraatoppervlakken speelt. Kelvin sonde kracht microscopie (KPFM) is een module van atomic force microscopie (AFM) dat het contact potentiaalverschil tussen oppervlakken op nano-schaal meet. De combinatie van KPFM AFM maakt gelijktijdige opwekking van oppervlaktepotentiaal en topografische kaarten van biologische monsters zoals bacteriële cellen. Hier maken we KPFM de effecten van de oppervlakte potentiaal op microbiële hechting op medisch relevante oppervlakken zoals roestvrij staal en goud onderzoeken. Oppervlakte potentiaalkaarten geopenbaard verschillen in oppervlaktepotentiaal microbiële membranen van verschillende materialen substraten. Een stap hoogte grafiek werd gegenereerd om het verschil in oppervlaktepotentiaal show in een grensgebied tussen het substraatoppervlak en micro-organismen. Veranderingen in cellulaire membraan oppervlaktepotentiaal zijn verbonden met overstaps in cellulaire metabolisme en motiliteit. Daarom KPFM is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om de veranderingen van microbiële membraanoppervlak potentieel bij hechting op diverse substraatoppervlakken onderzoeken. In deze studie demonstreren we de procedure voor de oppervlaktepotentiaal van individuele methicilline-resistente Staphylococcus aureus USA100 cellen te karakteriseren op roestvrij staal en goud met KPFM.
Biofilms geproduceerd op apparatuur oppervlakken en in huidwonden een probleem vormen voor de medische industrie als biofilms zijn recalcitrant te verwijderen en kan leiden tot een verhoogde tarieven van de overdracht van ziekten en antimicrobiële resistentie. Hechting is de eerste stap in biofilmvorming en is de meest kritische stap vanwege de omkeerbaarheid 1-3. Substraat oppervlakte-eigenschappen spelen een cruciale rol op de microbiële gehechtheid. Factoren zoals oppervlakte hardheid, porositeit, ruwheid en hydrofobiciteit is aangetoond dat bacteriële hechting te bewerkstelligen; Er is echter weinig onderzoek naar de invloed van substraatoppervlak potentiaal (SP) op microbiële adhesie gedaan 4,5. Negatief geladen oppervlakken te voorkomen de bevestiging van Bacillus thuringiensis sporen mica, silicium, goud en 6. Veranderingen in cellulaire membraanpotentiaal wijzen op veranderingen in cellulaire hechting en motiliteit 5,7. Het is waargenomen dat elektrisch homogeneous oppervlak te bevorderen microbiële adhesie 5. Karakterisering van de oppervlaktepotentiaal van bacteriën op nanoschaal kan een nieuwe manier om de hechting kinetiek van bacteriën voor verschillende ondergronden begrijpen verschaffen, en daardoor kan helpen bij de ontwikkeling van anti-biofouling strategieën. In tegenstelling tot andere methoden voor het karakteriseren van de electro kinetiek bacteriën zoals elektroforetische lichtverstrooiing, zeta potentiaal en isoelektrisch punt bepalen, Kelvin probe force microscopie (KPFM) maakt het onderzoek van individuele cellen in plaats van gehele kweken 8-11. Dit is gunstig wanneer willen vergelijken cel-cel of biofilm elektrische kenmerken met een hoge nauwkeurigheid en precisie.
KPFM is een module van atomaire kracht microscopie (AFM). AFM werd ontwikkeld als een direct gevolg van de scanning tunneling microscoop (STM) 12. De eerste gepubliceerde beelden met behulp van STM werden gedaan door Gerd Binnig en Heinrich Rorhrer in 1982 12 </sup>. Hun uitvinding was in staat om atoomstructuren lossen door Rasterscanning een scherpe geleidende tip over een geleidend oppervlak in de lucht. De implicaties van het bereiken van een hoge-resolutie beelden opgewonden biologen die snel geprobeerd om STM gebruiken om het beeld gedroogde monsters van DNA, eiwitten en virussen 12. STM kan ook in vloeistoffen met gespecialiseerde meetpennen 13. Dit werd aangetoond door Lindsay et al., Die STM en AFM gebruikt om beelden DNA moleculen in 10 mM HClO 4 en water, op goud elektroden 13. KPFM is aangetoond in het bepalen van de oppervlaktepotentiaal van DNA en eiwitanalyse 25 en biomoleculen interactie met liganden 26.
KPFM werkt door het meten van het contact potentiaalverschil (CPD) tussen een AFM geleidende cantilever tip en een ideaal geleidende monster (Figuur 1, i) 14,15. Monsters niet noodzakelijkerwijs geleidende (dwz biologische Sampl zijnes). Imaging kan op mica, glas en silicium oppervlakken (niet geleidend), zolang de niet-geleidende oppervlak dun en er een onderliggend geleidend materiaal 6,7 uitgevoerd. De CPD is gelijk aan de oppervlaktepotentiaal spanning en kan worden omschreven als het verschil in de werkfuncties tussen de tip (φ tip) en monster (φ monster), gedeeld door de negatieve elektron lading (- e). Wanneer een geleidende AFM tip dicht wordt gebracht op een monsteroppervlak (gescheiden door afstand d), een elektrostatische kracht (F n) gegenereerd door het verschil in Fermi energie (Figuur 1, ii, a) 15. Op dit punt, het vacuüm energieën van de tip en monster (E v) in evenwicht en uitgelijnd. Bij het brengen van de punt dichter bij het monster oppervlak, de tip en sample oppervlak in elektrisch contact en fungeren als parallelle plaat condensatoren (Figuur 1, ii, b komen </strong>) 14,15. Op het moment, de Fermi energie van de tip en monsteroppervlak gelijkgericht raken, tot een steady-state-evenwicht (figuur 1, ii, b). De tip en sample oppervlak wordt in rekening gebracht en een V CPD zal vormen als gevolg van een verschil in E v 's en werkfuncties. Acts Een F es op het elektrisch contact gebied als gevolg van de gevormde V CPD. Deze kracht wordt vervolgens vernietigd door toepassing van een externe V DC aan de tip die dezelfde grootte als de gevormde V CPD heeft (figuur 1, ii, c). Dit gold gelijkspanning elimineert oppervlaktelading op het gebied van elektrisch contact, en de hoeveelheid V DC noodzakelijk de F es V CPD elimineren is gelijk aan het verschil in de werkfuncties tussen de sample oppervlak en tip 15. Opgemerkt zij dat de werkfunctie van de tip is bekend en wordt geleverd door de fabrikanten. In alle KPFM werkwijzen, een AC spanning (V AC, ongeveer 100-500 mV) wordt ook toegepast op de tip om oscillerende elektrische kracht tussen de tip en monster 14 genereren. Dit zorgt voor een betere resolutie bij het meten van veranderingen in de V CPD en / of F es. In dit opzicht kunnen veranderingen in de frequentie of amplitude van de elektrische oscillatie worden gecorrigeerd door V DC en oppervlakte potentiaalkaarten kunnen worden gegenereerd. Gegevens van specifieke gebieden van deze kaarten kan verder worden geanalyseerd om de elektrische informatie over specifieke topografische kenmerken bieden.
KPFM kan in drie modi: (1) lift stand (2) amplitudemodulatie (AM) modus, en (3) frequentiemodulatie (FM) modus 14,16. Lift-modus was de eerste incarnation van KPFM. Lift-modus is gebaseerd op een twee-pass-methode waarbij een kronkelende tip wordt gesleept over het oppervlak om een topografische afbeelding te verkrijgen. Voor de tweede pas het topje omhoog staat een vooraf ingestelde afstand boven het monster (10-100 nm) en terug over hetzelfde gebied gescand. Door deze twee-pass-methode, lift-modus, in vergelijking met AM- en FM-KPFM, neemt de langste tijd voor het acquisitie. Het verhogen van de tip van het oppervlak zorgt ervoor dat alleen lange afstand F es gemeten. Ook wordt overspraak tussen topografie en oppervlaktepotentiaal metingen ontkoppeld ten koste van toegenomen laterale resolutie en gevoeligheid.
AM-KPFM verbetert de laterale resolutie en gevoeligheid door het gebruik van dual-frequenties voor het gelijktijdig meten monster topografie en oppervlaktepotentiaal (one-pass scan) 14. In de AM-modus, wordt de cantilever mechanisch schommelde, in het algemeen 5% onder het eerste resonantiefrequentie (f 0), en elektrisch schommelde (through een V AC) bij zijn tweede resonantiefrequentie (f 1). Veranderingen in de amplitude van f 0 leidt tot het genereren van topografische gegevens, terwijl veranderingen in de amplitude van f1, door veranderingen in F es en V CPD geven oppervlaktepotentiaalmeter meetgegevens. f 0 en f 1 van de cantilever gescheiden door belangrijke frequenties en energieën signaal overspraak geminimaliseerd 14. Het hoofd elektronica doos (HEB) van de AFM scheidt de twee signalen om zowel topografische geven en oppervlakte potentiële gegevens tegelijkertijd in één scan. FM-KPFM verbetert de resolutie nog verder dan het AM-KPFM op biologische oppervlakken 14. FM-KPFM werkt anders dan de AM-KPFM in dat het meet de ontwikkeling van elektrostatische kracht hellingen in plaats van elektrostatische kracht (F n) 15. Net als de AM-modus, FM-modus maakt gebruik van dual-frequenties en formae bypass aftastmechanisme verkrijgen topografische en oppervlaktepotentiaal gegevens tegelijk 14. In de FM-modus wordt de cantilever mechanisch schommelde bij f 0 en elektrisch schommelde bij een lage gewijzigde frequentie (f mod, meestal 1-5 kHz). Bij elektrostatische interacties, f 0 en f mod mix te zijbanden f 0 ± f mod te produceren. De zijbanden zijn zeer gevoelig voor elektrostatische kracht, en kan uit f 0 gescheiden door AFM HEB. Aangezien FM-KPFM meet de ontwikkeling van elektrostatische kracht hellingen, de tips apex vorm en het onderhoud / integriteit spelen een cruciale rol in de totale oppervlakte potentieel resolutie 14, 15. Oppervlaktepotentiaal resolutie met behulp van AM en FM-modi zijn in het bereik van 1 nm zijwaarts 14 -16. Opgemerkt zij dat KPFM beeldvorming kan worden uitgevoerd in niet-polaire vloeistoffen, en meer recent is aangetoond worden gedaan low-ionische (<10 mM) polaire vloeistoffen (inopen lus KPFM modes die geen vertekening terugkoppeling vereisen, waardoor het niet toepassen van een DC-bias) zoals MilliQ water; echter KPFM beeldvorming nog gebeuren op levende cellen in polaire oplossingen 17-20. Extra uitdagingen van SP beeldvorming vloeistof die oplossingen gebruikt voor het handhaven cellen (bijvoorbeeld, fosfaat gebufferde zoutoplossing) hebben hoge concentraties van mobiele ionen, hetgeen leidt tot Faraday reacties, diagonaal-geïnduceerde lading dynamiek en ionendiffusie / herverdeling 20. Zo dit experiment werden metingen genomen van gedroogd en MRSA dode cellen op poly-L-lysine gefunctionaliseerde roestvrij staal en goud oppervlakken onder omgevingsomstandigheden. Beeldvorming kan plaatsvinden onder omstandigheden lucht of vacuüm worden uitgevoerd op biologische monsters die eerder zijn gedroogd of geïmmobiliseerd op oppervlakken 20. Vochtige omstandigheden hebben ook aangetoond KPFM beeldvorming oppervlakken 6 beïnvloeden.
In deze studie hebben we gebruikt FM-KPFMAFM en de rol van SP op de bevestiging van methicilline-resistente Staphylococcus aureus USA100 (MRSA) poly-L-lysine gefunctionaliseerde roestvrij staal en goud oppervlakken onderzoeken. MRSA is onlangs oogstte status als een multi-resistente (MDR) "superbacterie" vanwege zijn natuurlijke geselecteerde bestendigheid tegen vele β-lactam antibiotica en cefalosporinen 21. MRSA infecties zijn nu moeilijker, moeilijker en formidabele te behandelen, waardoor het gebruik van hardere antibiotica zoals vancomycine en oxazolidinonen die hogere toxiciteit bij mensen hebben, en daarom niet als langdurige behandeling 22. Roestvrij staal werd gekozen vanwege zijn medisch belang en gemeenschappelijk gebruik als materiaal in injectienaalden, ondersteken, deurkrukken, putten, enz goud werd gebruikt als vergelijkende metaal. FM-KPFM werd gebruikt om te onderzoeken of microbiële membraan SP veranderingen na bevestiging aan de substraten.
KPFM werd gebruikt als een nieuwe techniek voor het verkrijgen van elektrische oppervlakteweerstand gegevens. Het is algemeen gebruikt als een methode voor de behandeling ladingsverdeling chemie en is pas sinds kort worden voor de studie van biologische systemen micro- en nano-schaal. Uit de verzamelde gegevens bleek dat microben leek niet gemakkelijk hechten aan roestvrij staal en goud reinigen oppervlakken, zelfs na 3 uur van statische incubatie. Poly-L-lysine gefunctionaliseerde oppervlakken liet snelle microbiële h…
The authors have nothing to disclose.
The authors sincerely thank the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, the Ontario Ministry of Research and Innovation, and the Canada Foundation for Innovation for funding this study.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
5500ILM Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | #N9435S | |
AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16219 | Stainless steel sample discs |
DPE (Low-Noise) Conductive SPM Probes | Mikromasch | #HQ:DPE-XSC11 | There are 4 Pt-coated cantilevers per chip. We utilized cantilever B for experiments. |
PELCO Gold Coated AFM/STM Metal Specimen Discs | TED PELLA, INC. | #16218-G | Gold sample discs |
PicoView Software | Agilent Technologies | #N9797B | 5500ILM Atomic Force Microscope imaging software |
Pico Image Software (Pico Image Basic) | Agilent Technologies | #N9797AU-1FP | 5500 ILM Atomic Force Microscope post-image processing software |
Scilogex D3024 High Speed Micro-Centrifuge | Thomas Scientific | #91201513 | Centrifuge used in cell-washing steps to separate cells (pellet) from media |
Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BD | #221261 | Pre-made plates |
Tryptic Soy Broth | BD | #257107 | Comes as a dry powder. Instruction on how to make come on the container. |