Summary

Une approche Cell biorapporteur entières pour évaluer transport et la biodisponibilité des contaminants organiques dans les systèmes insaturés eau

Published: December 24, 2014
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Summary

Toute une analyse de biorapporteur cellulaire avec Burkholderia sartisoli RP037-MCHE a été développé pour détecter fractions d'un contaminant organique (par exemple, le fluorène) disponible pour la dégradation bactérienne après le transport actif par mycéliums de pontage des pores remplis d'air dans un système de modèle insaturé de l'eau.

Abstract

Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.

Introduction

Le sol est densément peuplé par une large gamme de micro-organismes tels que les bactéries 1,2. Cependant, les conditions dans cet habitat sont difficiles, notamment en termes de disponibilité de l'eau 3. Les bactéries ont besoin en permanence à la recherche de conditions optimales dans des environnements hétérogènes quatre, mais l'absence de films d'eau continues se traduit par une mobilité restreinte 5 les empêchant de se propager librement. En outre, les taux de diffusion de solutés (par exemple, les éléments nutritifs) sont abaissés dans des conditions insaturés 6. Ainsi, les bactéries et les nutriments sont souvent physiquement séparés et l'accessibilité des éléments nutritifs est limitée 3. Par conséquent, un vecteur de transport pour des composés chimiques qui ne nécessite pas une phase aqueuse continue peut aider à surmonter ces limitations. En fait, de nombreux micro-organismes tels que les champignons et oomycètes ont développé une forme de croissance filamenteuse leur permettant de se développer à travers les pores remplis d'air et atteindre ainsi mobilizing aussi physique nutriments 7 et 8 substances carbonées séparé sur de longues distances. Ils peuvent même agir comme des vecteurs de transport biologiques qui fournissent des sucres et d'autres sources d'énergie à 9 bactéries. Absorption et le transport dans les organismes de mycélium a également été montré pour les polluants organiques hydrophobes tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) dans Pythium ultimum 10 ou à 11 champignons mycorhiziens. Depuis HAP sont des contaminants solubles dans l'eau omniprésents et mal 12 dans le sol, le transport de mycélium médiation pourrait aider à augmenter la biodisponibilité des contaminants bactériens pour dégradeurs potentiels. Considérant que le montant total de transport de contaminants peut être quantifiée directement par des moyens chimiques 10, la biodisponibilité des contaminants transportés par mycélium bactéries dégradant et d'autres organismes ne peut être évaluée facilement.

Le protocole suivant présente une méthode pour évaluer l'impact de mycelia sur la biodisponibilité des contaminants bactériens à dégradeurs d'une manière directe; il permet la collecte d'informations sur l'impact spatio-temporelle des contaminants sur les écosystèmes microbiens. Nous décrivons comment mettre en place un système de microcosme insaturé élaborée imitant interfaces air-eau dans le sol en reliant une source ponctuelle de HAP séparés physiquement avec biorapporteur bactéries HAP dégradants par des vecteurs de transport mycéliens. Parce que le transport aérien est exclu, l'effet du transport mycélium basée sur les HAP biodisponibilité pour les bactéries peut être étudié de manière isolée. Dans le détail, le RP037-MCHE de trois anneaux HAP fluorène, l'organisme mycélium Pythium ultimum et de la bactérie Burkholderia biorapporteur 13 ont été appliquées dans les configurations décrites microcosme. La bactérie B. sartisoli RP037-MCHE a été construit pour étudier phénanthrène flux à la cellule 14 et exprime améliorées protéine fluorescente verte (eGFP) à la suite de la HAP aux fluxla cellule, alors que la fluorescence rouge mCherry est exprimé de façon constitutive. Des informations détaillées sur la construction rapporteur est donnée par Tecon et al. 13 Dans les tests préliminaires, la bactérie n'a pas révélé de natation et seulement la capacité d'essaimage très lent. Il a été en mesure de migrer lentement hyphes de Pythium ultimum lorsqu'il est appliqué comme une suspension dense sur le dessus des hyphes. Comme les bactéries ont été intégrés dans l'agarose dans le protocole suivant, la migration sur les hyphes n'a pas eu lieu.

En utilisant la microscopie confocale à balayage laser (CLSM), les bactéries biorapporteur peuvent être visualisées directement dans les microcosmes et l'expression de eGFP peut être quantifiée par rapport à la quantité de cellules (proportionnelle au signal mCherry) à l'aide de la ImageJ logiciel. Ce permet de comparer la biodisponibilité qualitativement différents scénarios (ce est à dire, supérieur ou inférieur). FLU est révélée être biodisponible après le transport du mycélium de P. ultimum (ie, ilétait plus élevé que dans un contrôle négatif). En outre, le protocole décrit comment quantifier la quantité totale de transport de mycélium à médiation par des moyens chimiques et de vérifier la biodisponibilité des contaminants en utilisant des fibres de verre revêtu de silicium (fibres SPME) dans des microcosmes identiques. Résultats en utilisant cette configuration microcosme ont été publiés et discuté pour la combinaison de P. ultimum, le fluorène et B. sartisoli RP037-MCHE 15. Ici, l'accent est mis sur une description détaillée de la méthode et l'identification des pièges potentiels du protocole de fournir cette connaissance pour d'autres applications potentielles. D'autres applications peuvent impliquer différents fongique, espèces bactériennes (par exemple, provenant de sites contaminés), et d'autres contaminants (par exemple, les pesticides) ou d'un contaminant d'alimentation (par exemple, les sols âgés).

Protocol

1. Préparation de plats, des diapositives et incubation Chambers Préparer le matériel suivant pour chaque microcosme: une grande boîte de Petri en plastique inférieure (d = 10 cm), une modification (voir l'étape 1.2) petite boîte de Petri en plastique inférieure (d = 5 cm) avec des couvercles et une chambre de comptage diapositive avec trois cavités. Prenez le nombre désiré de Petri parties inférieures plat (d = 5 cm). Enlever une partie du bord avec une scie pour se adapter exacteme…

Representative Results

Les résultats présentés ici ont déjà été publiés plus tôt 15. Se il vous plaît se référer à l'article de discussion mécaniste et environnementale détaillée. Après l'enregistrement d'image par CLSM, une projection d'intensité maximale peut être réalisée en utilisant le logiciel de microscope respective ou ImageJ pour gagner une première impression visuelle de l'échantillon et les contrôles (figure 2). Plus tard, les ensem…

Discussion

La configuration du microcosme présenté est avéré approprié pour étudier la biodisponibilité des produits chimiques spatialement séparés pour les organismes après absorption et le transport par mycélium dégradant. Potentiel de transport en phase gazeuse de composés volatils en partie est empêchée et les cellules bactériennes biorapporteur peut être visualisé sans préparation de l'échantillon complexe, et donc avec une perturbation minimale du système sensible. Dans le même temps, l'analyse …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit Würz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the ‘Chemicals in the Environment’ (CITE) research program of the Helmholtz Association.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Confocal Microscope Leica TCS SP5X, LAS AF – Version 2.6.1; or equivalent CLSM
GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD Agilent an equivalent GC/MS may be used
GC capillary column J&W 121-5522              Agilent
Cork borer Fisher Scientific 12863952 or any other
Cover slips Marienfeld 107222 High performance, No.1.5H
GC/MS insterts WICOM WIC 47080
GC/MS vials 2 ml WICOM WIC 41150
Lids / septa for screw cap vials DIONEX 49463 / 049464 
Lids for GC/MS vials WICOM WIC 43948/B
Objective Slides Menzel ordinary
PDMS coated glass fibers Polymicro Technologies, Inc. V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µL m-1
Petri Dishes small / big Greiner 633-102 / 628-102
Screw cap vials 40 ml DIONEX 48783 other glass vials may be used
Screw cap vials 60 ml DIONEX 48784 other glass vials may be used
Acenaphthylene d08 Dr. Ehrenstorfer C 20510100
Acetone Carl Roth 9372.2
Activated carbon Sigma-Aldrich 242276-1kg
Agarose Carl Roth 2267.4
Fluorene Fluka 46880
Kanamycin sulfate Carl Roth T832.2 50 mg L-1
Methanol Carl Roth P7171
Minimal Medium: 100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest
  Solution 1
    Ammonium sulfate  Carl Roth 3746.1 5 g L-1 
    Magnesium chloride x 6 H2O Carl Roth 2189.1 1 g L-1
    Calcium nitrate x 4 H2O Carl Roth P740.1 0.5 g L-1
  Solution 2
    Disodium phosphate Carl Roth P030.1 55.83 g L-1
    Monopotassium phosphate Carl Roth 3904.1 20 g L-1
  Solution 3 pH 6.0
    Disodium EDTA MERCK 1084180250 0.8 g L-1
    Iron(II) chloride x 4 H2O MERCK 1038610250 0.3 g L-1
    Cobalt(II) chloride x 6 H2O Carl Roth T889.3 4 mg L-1
    Manganese(II) chloride x 1 H2O        Carl Roth   4320.2 10 mg L-1
    Copper(II) sulfate Carl Roth  P023.1 1 mg L-1
    Sodium molybdate x 2 H2O Carl Roth  0274.1 3 mg L-1
    Zinc chloride MERCK 1088160250 2 mg L-1
    Lithium chloride Carl Roth P007.1 0.5 mg L-1
    Tin(II) chloride x 2 H2O Carl Roth 4473.1 0.5 mg L-1
    Boric acid Riedel-de-Haen              11606 1 mg L-1
    Potassium bromide Carl Roth A137.1 2 mg L-1
    Potassium iodide Carl Roth 6750.1 2 mg L-1
    Barium chloride Carl Roth 4453.1 0.5 mg L-1
MMA Minimal medium + agarose 0.2 %
Phenanthrene d10 Dr. Ehrenstorfer C 20920100
Potato Dextrose Agar: 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8
    Potato Dextrose broth Difco/ Beckton Dickinson 254920
    Bacto-agar Difco/ Beckton Dickinson 214040
Sodium acetate x 3 hydr. Carl Roth 6779.1
Sodium sulfate MERCK  1066495000
Toluene MERCK 1083252500
mTY medium: 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl
    Yeast extract Merck 1037530500
    Tryptone Serva 4864702
    Sodium chloride Carl Roth 3957.1
imageJ with logi tool plugin http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10
Pythium ultimum strain 67-1 Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland
Burkholderia sartisoli RP037-mChe Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland

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Cite This Article
Schamfuß, S., Neu, T. R., Harms, H., Wick, L. Y. A Whole Cell Bioreporter Approach to Assess Transport and Bioavailability of Organic Contaminants in Water Unsaturated Systems. J. Vis. Exp. (94), e52334, doi:10.3791/52334 (2014).

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