水不飽和システムにおける有機汚染物質の輸送および生物学的利用能を評価するために、全細胞バイオレポーターアプローチ
Summary
バークホルデリアsartisoli RP037-MCHEと全細胞バイオレポーターアッセイは、水飽和モデル系内の空気で満たされた細孔を橋渡し菌糸体により能動輸送後の細菌による分解に利用可能な有機汚染物質（ すなわち、フルオレン）の画分を検出するために開発されました。
Abstract
Bioavailability of contaminants is a prerequisite for their effective biodegradation in soil. The average bulk concentration of a contaminant, however, is not an appropriate measure for its availability; bioavailability rather depends on the dynamic interplay of potential mass transfer (flux) of a compound to a microbial cell and the capacity of the latter to degrade the compound. In water-unsaturated parts of the soil, mycelia have been shown to overcome bioavailability limitations by actively transporting and mobilizing organic compounds over the range of centimeters. Whereas the extent of mycelia-based transport can be quantified easily by chemical means, verification of the contaminant-bioavailability to bacterial cells requires a biological method. Addressing this constraint, we chose the PAH fluorene (FLU) as a model compound and developed a water unsaturated model microcosm linking a spatially separated FLU point source and the FLU degrading bioreporter bacterium Burkholderia sartisoli RP037-mChe by a mycelial network of Pythium ultimum. Since the bioreporter expresses eGFP in response of the PAH flux to the cell, bacterial FLU exposure and degradation could be monitored directly in the microcosms via confocal laser scanning microscopy (CLSM). CLSM and image analyses revealed a significant increase of the eGFP expression in the presence of P. ultimum compared to controls without mycelia or FLU thus indicating FLU bioavailability to bacteria after mycelia-mediated transport. CLSM results were supported by chemical analyses in identical microcosms. The developed microcosm proved suitable to investigate contaminant bioavailability and to concomitantly visualize the involved bacteria-mycelial interactions.
Introduction
土壌は、高密度に細菌などの微生物1,2の広い範囲によって入力されます。しかし、この生息地の条件は特に水の利用可能3換算で、挑戦的である。細菌は、恒久的に異機種環境4に最適な条件を探索する必要がありますが、連続した水膜の不在は、自由に広げるために、それらを妨げる制限されたモビリティ5になるさ。また、溶質の拡散速度（ 例えば、栄養素）は、不飽和条件6の下に低下する。そのため、細菌や栄養素は、多くの場合、物理的に分離され、栄養のアクセシビリティは3に制限されている。結果として、連続的な水相を必要としない化学化合物のための輸送ベクターは、これらの制限を克服するのに役立つ可能性がある。実際には、そのような真菌および卵菌などの多くの微生物がそれによって達するとmobiは空気で満たされた孔隙を通して成長できるようにすること糸状成長形を開発したlizingも物理的な長距離での栄養素7と炭素質8物質を分離した。彼らは細菌9に糖及び他のエネルギー源を提供し、生物学的輸送ベクターとして作用することができる。菌糸生物における取り込みと輸送はまた、このようなピシウムultimum 10またはアーバスキュラー菌根菌11で中の多環芳香族炭化水素（PAH）などの疎水性有機汚染物質のために示されている。 PAHは、ユビキタスと難水溶性汚染物質の土壌中の12であるため、菌糸体媒介輸送は、潜在的な細菌の分解者のための汚染物質の生物学的利用能を高めるために役立つかもしれない。汚染物質輸送の総量は化学によって直接定量することができるのに対し、分解細菌および他の生物に菌糸体によって輸送汚染物質の生物学的利用能を容易に評価することができない、10を意味する。
以下のプロトコルmyceの影響を評価するための方法を提示する直接的な方法で細菌の分解者への汚染物質の生物学的利用能にLIA。それは微生物の生態系への汚染物質の時空間への影響に関する情報を収集することができます。私たちは、菌糸輸送ベクターを経由してPAH分解バイオレポーター細菌と物理的に分離されたPAHの点光源をリンクすることによって土壌中の空気 – 水界面を模倣精巧な不飽和縮図システムを設定する方法について説明します。空中輸送が除外されているため、細菌PAHのバイオアベイラビリティに菌糸ベースの輸送の効果は、単離された方法で研究することができる。より詳細には、3環のPAHフルオレン、菌糸生物ピシウムultimumとバイオレポーター細菌バークホルデリアsartisoli RP037-MCHE 13を説明小宇宙の設定で適用した。細菌B. sartisoli RP037-MCHE、もともとセル14にフェナントレンフラックスを研究するために構築されたとするPAHフラックスの結果として、緑色蛍光タンパク質（eGFP）を発現増強赤の蛍光を発するmCherryをを構成的に発現される細胞。レポーター構築に関する詳細な情報はTecon らによって与えられている。予備試験では13、細菌は水泳とだけ非常に遅い群がる能力を認められなかった。それは、菌糸の上に高密度の懸濁液として適用された場合にピシウムultimumの菌糸にゆっくり移動することができました。細菌は以下のプロトコルでアガロースに包埋したので、菌糸上のマイグレーションが発生しなかった。
共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を用いて、バイオレポーター細菌はマイクロコズムで直接可視化することができるし、eGFPの発現は、ソフトウェアのImageJの助けを借りて（mCherryを信号に比例した）細胞の量に関連して定量することができる。これは、異なるシナリオに定性的生物学的利用能を比較することができ（ すなわち、より高いまたはより低い）。 FLUはP.によって菌糸輸送後に生物学的に利用可能であることが見出されたultimum（すなわち、それは、）陰性対照よりも高かった。さらに、プロトコルは、化学的な手段を介して菌糸体媒介輸送の総量を定量化すると、同一のマイクロコズムにおけるシリコンコーティングされたガラス繊維（SPME繊維）を使用して、汚染物質の生物学的利用能を確認する方法について説明します。この小宇宙のセットアップを使用して結果が公表され、Pの組み合わせのために議論されてきたultimum、フルオレン及びB. sartisoli RP037-MCHE 15。ここでは、焦点は、潜在的なさらなる用途のためにこの知識を提供するために、詳細な方法の説明とプロトコルの潜在的な落とし穴の同定に位置しています。さらにアプリケーションは、さまざまな真菌、（汚染されたサイトからの例えば、）細菌種、および他の汚染物質（ 例えば、殺虫剤）または汚染物質の供給（ 例えば、高齢の土壌）を含むことができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示縮図のセットアップは菌糸体による取り込みおよび輸送の後に生物を劣化させることに空間的に分離され、化学物質の生物学的利用能を研究するのに適して証明した。部分的に揮発性化合物の潜在的気相輸送が防止され、細菌のバイオレポーター細胞が重要なシステムの最小の妨害で、従って精巧なサンプル調製を必要とせずに可視化することができる。同時に、サンプルの化学分析が?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding by the German Environmental Foundation (DBU) is acknowledged. The authors thank Ute Kuhlicke for technical help with CLSM analysis and Birgit Würz, Rita Remer, and Jana Reichenbach for skilled experimental help. The authors would particularly like to thank Prof. Jan Roelof van der Meer and Dr. Robin Tecon for fruitful discussion and providing the bioreporter strain. It contributes to the ‘Chemicals in the Environment’ (CITE) research program of the Helmholtz Association.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP5X, LAS AF – Version 2.6.1; or equivalent CLSM | |
| GC HP 7890 Series GC and Agilent 5975C MSD | Agilent | an equivalent GC/MS may be used | |
| GC capillary column J&W 121-5522 | Agilent | ||
| Cork borer | Fisher Scientific | 12863952 | or any other |
| Cover slips | Marienfeld | 107222 | High performance, No.1.5H |
| GC/MS insterts | WICOM | WIC 47080 | |
| GC/MS vials 2 ml | WICOM | WIC 41150 | |
| Lids / septa for screw cap vials | DIONEX | 49463 / 049464 | |
| Lids for GC/MS vials | WICOM | WIC 43948/B | |
| Objective Slides | Menzel | ordinary | |
| PDMS coated glass fibers | Polymicro Technologies, Inc. | V (PDMS) = 13.55 ± 0.02 µL m-1 | |
| Petri Dishes small / big | Greiner | 633-102 / 628-102 | |
| Screw cap vials 40 ml | DIONEX | 48783 | other glass vials may be used |
| Screw cap vials 60 ml | DIONEX | 48784 | other glass vials may be used |
| Acenaphthylene d08 | Dr. Ehrenstorfer | C 20510100 | |
| Acetone | Carl Roth | 9372.2 | |
| Activated carbon | Sigma-Aldrich | 242276-1kg | |
| Agarose | Carl Roth | 2267.4 | |
| Fluorene | Fluka | 46880 | |
| Kanamycin sulfate | Carl Roth | T832.2 | 50 mg L-1 |
| Methanol | Carl Roth | P7171 | |
| Minimal Medium: | 100 mL solution 1 + 25 mL solution 2 + 5 mL solution 3 ad. 1000 mL aqua dest | ||
| Solution 1 | |||
| Ammonium sulfate | Carl Roth | 3746.1 | 5 g L-1 |
| Magnesium chloride x 6 H2O | Carl Roth | 2189.1 | 1 g L-1 |
| Calcium nitrate x 4 H2O | Carl Roth | P740.1 | 0.5 g L-1 |
| Solution 2 | |||
| Disodium phosphate | Carl Roth | P030.1 | 55.83 g L-1 |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | 20 g L-1 |
| Solution 3 | pH 6.0 | ||
| Disodium EDTA | MERCK | 1084180250 | 0.8 g L-1 |
| Iron(II) chloride x 4 H2O | MERCK | 1038610250 | 0.3 g L-1 |
| Cobalt(II) chloride x 6 H2O | Carl Roth | T889.3 | 4 mg L-1 |
| Manganese(II) chloride x 1 H2O | Carl Roth | 4320.2 | 10 mg L-1 |
| Copper(II) sulfate | Carl Roth | P023.1 | 1 mg L-1 |
| Sodium molybdate x 2 H2O | Carl Roth | 0274.1 | 3 mg L-1 |
| Zinc chloride | MERCK | 1088160250 | 2 mg L-1 |
| Lithium chloride | Carl Roth | P007.1 | 0.5 mg L-1 |
| Tin(II) chloride x 2 H2O | Carl Roth | 4473.1 | 0.5 mg L-1 |
| Boric acid | Riedel-de-Haen | 11606 | 1 mg L-1 |
| Potassium bromide | Carl Roth | A137.1 | 2 mg L-1 |
| Potassium iodide | Carl Roth | 6750.1 | 2 mg L-1 |
| Barium chloride | Carl Roth | 4453.1 | 0.5 mg L-1 |
| MMA | Minimal medium + agarose 0.2 % | ||
| Phenanthrene d10 | Dr. Ehrenstorfer | C 20920100 | |
| Potato Dextrose Agar: | 24 g L-1 broth + bacto-agar 1.5 %; pH 6.8 | ||
| Potato Dextrose broth | Difco/ Beckton Dickinson | 254920 | |
| Bacto-agar | Difco/ Beckton Dickinson | 214040 | |
| Sodium acetate x 3 hydr. | Carl Roth | 6779.1 | |
| Sodium sulfate | MERCK | 1066495000 | |
| Toluene | MERCK | 1083252500 | |
| mTY medium: | 3 g L-1 yeast extract, 5 g L-1 bacto tryptone and 50 mM NaCl | ||
| Yeast extract | Merck | 1037530500 | |
| Tryptone | Serva | 4864702 | |
| Sodium chloride | Carl Roth | 3957.1 | |
| imageJ with logi tool plugin | http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html and http://downloads.openmicroscopy.org/bio-formats/4.4.10 | ||
| Pythium ultimum strain 67-1 | Obtained from the lab of Dr. Christoph Keel; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland | ||
| Burkholderia sartisoli RP037-mChe | Obtained from the lab of Prof. Jan Roelof van der Meer; Department of Fundamental Microbiology, University of Lausanne, Switzerland |
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