Двухфотонное изображений внутриклеточного Ca<sup> 2+</sup> Погрузочно-разгрузочные работы и оксид азота производства в эндотелиальных и гладкомышечных клеток изолированной аорты крыс
Summary
Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Abstract
Кальций очень важный регулятор многих физиологических процессов в тканях сосудов. Большинство эндотелиальных и гладкомышечных функции сильно зависят от изменений внутриклеточного кальция ([Ca2 +] I) и оксида азота (NO). Для того, чтобы понять, как [Ca 2+] я, нет и вниз по течению молекулы обрабатываются кровеносного сосуда в ответ на сосудосуживающих и сосудорасширяющих, мы разработали новый метод, который применяется кальций-маркировку (или NO-маркировку) красители с двумя фотонов микроскопии для измерения обработку кальция (или NO) производства в отдельных кровеносных сосудов. Описанный здесь подробно, шаг за шагом процедура, которая демонстрирует, как изолировать аорты от крыс, этикетки кальция или НЕТ в эндотелиальных или гладкомышечных клеток, и изображение кальция переходные (или НЕТ производство), используя два фотона микроскоп следующие физиологические или фармакологические раздражители. Преимущества использования метода являются несколько раз: 1) это возможно одновременноелы измерения переходных кальция в обоих эндотелиальных клеток и гладкомышечных клеток в ответ на различные стимулы; 2) позволяет изображения эндотелиальных клеток и клеток гладких мышц в их родной обстановке; 3) этот метод очень чувствителен к внутриклеточного кальция или без изменений и генерирует изображения высокого разрешения для точных измерений; и 4) Описанный подход может быть применен к измерению другими молекулами, такими как активными формами кислорода. В целом, применение двух фотонов микроскопии лазерного излучения для контроля переходных кальция и не производство в эндотелиальных и гладкомышечных клеток изолированного кровеносного сосуда предоставил высококачественные и количественные данные способствовало наше понимание механизмов, регулирующих функции сосудов.
Introduction
Кальций является основным вторичным посредником в сосудистых клетках, таких как эндотелиальных и гладкомышечных клеток. Это основной стимул для сокращения сосудов и играет важную роль в расширении сосудов, в том числе его последствий через NO поколения в эндотелия. Из-за ограничений технологии формирования, это было практически невозможно наблюдать обработку кальция в неповрежденной судна. Развитие двух систем визуализации фотонов и создания новой кальция или Нет маркировки красителей, делает возможным изображение на достаточной глубине и разрешения, чтобы начать понимать динамику кальция и не производство внутри сосудов.
Два фотона микроскопии недавно были применены в ткани, органы и даже целые исследования на животных из-за его превосходной способностью глубоко проникать в ткани с низкой фоновой флуоресценции и высокой чувствительностью сигнала. 1,2 узкий спектр возбуждения двух фотонов в Подсветкаионная фокусом и использование не-descanned детекторов причины, почему два фотона микроскопии превосходит традиционные конфокальной микроскопии. Конфокальной микроскопии не может производить высококачественные изображения на необходимую глубину тканей вследствие авто-флуоресценции и рассеяния из фокуса света в конфокальной обскуры. Следовательно, мы разработали метод, используя два фотона микроскоп для измерения [Ca 2+] я сигнализации и нет производства в неповрежденных, отдельных клеток кровеносных сосудов с высоким разрешением и низким коэффициентом сигнал-шум.
Protocol
Representative Results
Discussion
Экспериментальная Обзор. Чтобы лучше понять вклад кальция и НЕТ сосудистой физиологии, новый метод был разработан для измерения [Ca 2+] я и НЕТ в гладких мышцах и клетках эндотелия аорты изолированных интактных. Вместе этот протокол состоит из следующих основных шагов: 1) …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Уильяма Cashdollar, и Northwestern Mutual Foundation Imaging центр в крови научно-исследовательского института штата Висконсин за помощь в исследованиях изображений. Мы также благодарим доктора Дарья Ilatovskaya для критического чтения этой рукописи и полезные обсуждения. Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения грантов HL108880 (как) и DP2-OD008396 (в AMG).
Materials
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-Name | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM – a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
