De dos fotones de imágenes de Ca intracelular<sup> 2 +</sup> Manejo y producción de óxido nítrico en el endotelio y las células del músculo liso de la aorta de rata aislada
Summary
Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.
Abstract
El calcio es un regulador muy importante de muchos procesos fisiológicos en los tejidos vasculares. La mayoría de las funciones endoteliales y de músculo liso dependen en gran medida de los cambios en el calcio intracelular ([Ca2 +] i) y óxido nítrico (NO). Con el fin de entender cómo [Ca 2 +] i, NO y moléculas de aguas abajo son manejados por un vaso sanguíneo en respuesta a vasoconstrictores y vasodilatadores, hemos desarrollado una nueva técnica que se aplica en calcio etiquetado (o NO-etiquetado) tiñe con dos fotones microscopía para medir el manejo del calcio (o la producción de NO) en los vasos sanguíneos aislados. Descrito aquí es un procedimiento que se detalla paso a paso que muestra cómo aislar una aorta de una rata, calcio etiqueta o NO en las células endoteliales o de músculo liso, y la imagen de los transitorios de calcio (o la producción de NO) utilizando un microscopio de dos fotones siguiente fisiológica o estímulos farmacológicos. Los beneficios de usar el método son multi-pliegue: 1) es posible simultáneaLy medir los transitorios de calcio en ambos células endoteliales y células del músculo liso en respuesta a diferentes estímulos; 2) le permite a uno a las células imagen endoteliales y células musculares lisas en su entorno nativo; 3) este método es muy sensible al calcio intracelular o ningún cambio y genera imágenes de alta resolución para mediciones precisas; y 4) enfoque descrito se puede aplicar a la medición de otras moléculas, tales como las especies reactivas del oxígeno. En resumen, la aplicación de dos fotones microscopía de emisión láser para controlar los transitorios de calcio y la producción de NO en las células endoteliales y de músculo liso de un vaso sanguíneo aislado haya facilitado datos cuantitativos de alta calidad y promovido nuestra comprensión de los mecanismos que regulan la función vascular.
Introduction
El calcio es un segundo mensajero fundamental dentro de las células vasculares tales como células endoteliales y musculares lisas. Es el estímulo primario para la contracción vascular y desempeña un papel importante en la dilatación vascular, incluyendo sus efectos a través de la generación de NO en el endotelio. Debido a las limitaciones de las tecnologías de formación de imágenes, ha sido prácticamente imposible observar el manejo del calcio dentro del recipiente intacto. El desarrollo de dos sistemas de imagen de fotones y la creación de nuevos calcio o NO tintes de etiquetado, hace posible la imagen a la profundidad y la resolución suficiente para empezar a entender la dinámica del calcio y la producción de NO dentro de la vasculatura.
Microscopía de dos fotones se ha aplicado recientemente en los tejidos, los órganos y los estudios en animales enteros, incluso debido a su capacidad superior para penetrar profundamente los tejidos con baja fluorescencia de fondo y la alta sensibilidad de la señal. 1,2 El estrecho espectro de excitación de dos fotones en el Iluminadorpunto focal de iones y el uso de detectores no descanned son las razones por las dos microscopía fotón es superior a la microscopía confocal tradicional. La microscopía confocal no puede producir imágenes de alta calidad en la profundidad del tejido necesario debido a la auto-fluorescencia y la dispersión de la luz fuera de foco en el agujero confocal. En consecuencia, hemos desarrollado un método que utiliza un microscopio de dos fotones para medir [Ca 2 +] i la señalización y la producción de NO en células intactas, los vasos sanguíneos individuales con una baja relación señal-ruido de alta resolución y.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descripción general Experimental. Para comprender mejor la contribución de calcio y NO a la fisiología vascular, un nuevo método fue desarrollado para la medición de [Ca2 +] i y NO en el músculo liso y las células endoteliales de aortas intactas aisladas. Juntos, este protocolo consta de estos pasos críticos: 1) aislamiento mecánico y preparación (digestión no enzimática) de la embarcación. Es importante mantener el tejido sano y intacta tanto como sea posible para obtener gra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. William Cashdollar, y la Fundación Centro de Imagen Northwestern Mutual en el Instituto de Investigación de la Sangre de Wisconsin para ayudar con los estudios de imagen. También agradecemos al Dr. Daria Ilatovskaya para la lectura crítica de este manuscrito y útil para el debate. Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud Subvenciones HL108880 (a AS) y DP2-OD008396 (a AMG).
Materials
| DAF-FM | Life Technologies | D-23842 | |
| Fluo 4 AM | Life Technologies | F14217 | 500µl in DMSO |
| Pluronic F-68 solution | Sigma-Aldrich | P5556 | |
| L-Name | Tocris | 0665 | |
| Olympus upright microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| MaiTai HP DeepSee-OL | Spectra Physics | Ti:sapphire laser 690nm — 1040nm | |
| Filters | Olympus | FV10-MRL/R | 495 to 540 nm |
| 25× water-immersion objective lens | Olympus | XLPL25XWMP | N.A. 1.05 and working distance 2 mm |
| Slice Anchor grid | Warner Instrument | SHD-27LH | |
| Other basic reagents | Sigma-Aldrich |
References
- Molitoris, B. A. Using 2-photon microscopy to understand albuminuria. Trans. Am. Clin. Climatol. Assoc. 125, 343-357 (2014).
- Burford, J. L., et al. Intravital imaging of podocyte calcium in glomerular injury and disease. J. Clin. Invest. 124, 2050-2058 (2014).
- Palygin, O., et al. Real-time electrochemical detection of ATP and H(2)O(2) release in freshly isolated kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 305, F134-F141 (2013).
- Ilatovskaya, D. V., et al. Single-channel analysis and calcium imaging in the podocytes of the freshly isolated. J Vis. Exp. In Press, (2015).
- Zhu, J., et al. Role of superoxide and angiotensin II suppression in salt-induced changes in endothelial Ca2+ signaling and NO production in rat aorta. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 291, H929-H938 (2006).
- Endres, B. T., et al. Mutation of Plekha7 attenuates salt-sensitive hypertension in the rat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 12817-12822 (2014).
- Williams, D. A., Fogarty, K. E., Tsien, R. Y., Fay, F. S. Calcium gradients in single smooth muscle cells revealed by the digital imaging microscope using Fura-2. Nature. 318, 558-561 (1985).
- Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J. Anat. 215, 682-691 (2009).
- Sathanoori, R., et al. Shear stress modulates endothelial KLF2 through activation of P2X4. Purinergic Signal. 11, 139-153 (2015).
- Hall, A. M., Molitoris, B. A. Dynamic Multiphoton Microscopy: Focusing Light on Acute Kidney Injury. Physiology. 29, 334-342 (2014).
- Campese, V. M. Salt sensitivity in hypertension. Renal and cardiovascular implications. Hypertension. 23, 531-550 (1994).
- Cowley, A. W. Genetic and nongenetic determinants of salt sensitivity and blood pressure. Am. J. Clin. Nutr. 65, 587S-593S (1997).
- Flister, M. J., et al. Identification of hypertension susceptibility loci on rat chromosome 12. Hypertension. 60, 942-948 (2012).
- Flister, M. J., et al. Identifying multiple causative genes at a single GWAS locus. Genome Res. 23, 1996-2002 (2013).
- Mattson, D. L., et al. Genetic mutation of recombination activating gene 1 in Dahl salt-sensitive rats attenuates hypertension and renal damage. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 304, R407-R414 (2013).
- Rudemiller, N., et al. CD247 modulates blood pressure by altering T-lymphocyte infiltration in the kidney. Hypertension. 63, 559-564 (2014).
- Flister, M. J., et al. CXM – a new tool for mapping breast cancer risk in the tumor microenvironment. Cancer Res. 74, 6419-6429 (2014).
