توصيف التوتة تسوية الأسلاف في جنين الفأر عن طريق<em> في فيفو</em> و<em> في المختبر</em> فحوصات
Summary
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Abstract
تميز التوتة تسوية الأسلاف من المهم أن نفهم مراحل ما قبل الغدة الصعترية التنمية الخلايا T، ضرورية لوضع استراتيجيات لT استبدال الخلايا في المرضى الذين يعانون lymphopenic. درسنا التوتة تسوية الأسلاف من الفئران الجنينية يوم 13 و 18 التوتة من قبل اثنين من تكميلي في المختبر وتقنيات الجسم الحي، سواء على أساس "شنقا قطرة" الأسلوب. يسمح هذا الأسلوب استعمار المشع فصوص الغدة الصعترية الجنين مع E13 و / أو E18 الأسلاف الغدة الصعترية تتميز CD45 علامات النمط الخيفي وبالتالي التالية ذريتها. الاستعمار المختلطة السكان يسمح تحليل الخلايا الخلافات الحكم الذاتي في خصائص بيولوجية من الأسلاف في حين الاستعمار سواء مع السكان يزيل ضغوط انتقائية تنافسية الممكنة. ويمكن أيضا أن فصوص الغدة الصعترية المستعمر أن المطعمة في الفئران المتلقي الذكور العوز المناعي يسمح للتحليل ناضجة الخلايا التائية ذرية في الجسم الحي، مثل ديناميات السكان رانه الطرفية جهاز المناعة، واستعمار الأنسجة والأعضاء المختلفة. كشفت الجنين الثقافات الجهاز الغدة الصعترية أن الأسلاف E13 تطورت بسرعة في جميع تنضج CD3 + الخلايا، وأدت إلى الكنسي فرعية الخلايا T γδ، والمعروفة باسم خلايا T الظهارية الجذعية. في المقابل، الأسلاف E18 لها تمايز وتأخر وكانت قادرة على توليد خلايا الظهارية T الجذعية. وأظهرت الفئران أيضا أن الأسلاف E18 التوتة تسوية تولد، مع مرور الوقت، أعداد أكبر من الخلايا الناضجة T من نظرائهم E13، وهي الميزة التي لا يمكن تقديره في التوتة الجنين على المدى القصير – رصد الدم المحيطي من المطعمة الغدة الصعترية CD3 – / ثقافات الجهاز.
Introduction
اللمفاويات التائية، التي تحمل αβ أو γδ الخلايا التائية مستقبلات (TCR)، تفرق في جهاز متخصص، والغدة الصعترية. ويتم تنظيم الغدة الصعترية كاملة النمو إلى منطقتين متميزتين: القشرة، حيث تتطور الأسلاف الغدة الصعترية، وحيث يتم إنقاذ thymocytes أن إعادة ترتيب الخلاق للβ TCR والجينات سلسلة α من الموت المبرمج (وهي عملية تعرف باسم الانتقاء الإيجابية)؛ والنخاع، حيث المختارة thymocytes مع تفاعل قوي جدا لبروابط الذاتي يتم حذف (اختيار السلبية) 1،2. الغدة الصعترية تنبع من طبقة الأديم الباطن من الحقيبة البلعوم الثالثة التي تحيط وقت لاحق من خلايا اللحمة المتوسطة 3. واستعمرت من قبل الأسلاف المكونة للدم ابتداء من يوم الجنينية E12، وبعد ذلك مطلوب التوظيف المستمر لT العادي تطوير خلية 4. المهاجرين الغدة الصعترية تتطور من خلال مراحل النمو المتعاقبة، مدبرة من قبل برنامج منظم بإحكام، بدأت ومايو ntained من خلال تفعيل إشارات المسار الشق على thymocytes على التفاعل مع يجند لها، مثل دلتا 4، أعرب عن الخلايا الظهارية الغدة الصعترية (TECS) 5.
تبدأ تطوير خلية توتية في ما يسمى CD4 – CD8 – النفي المزدوج (DN) مراحل. thymocytes DN يمكن تقسيم كذلك وفقا لتعبير عن CD25 CD44 وإلى DN1 (CD25 – CD44 +)، DN2 (CD25 + CD44 +)، DN3 (CD25 + CD44 -) وDN4 (CD25 – CD44 -). CD24 (هائل سعيد أنعم) وCD117 (ج كيت) يقسم كذلك مقصورة DN1 إلى 5 مجموعات فرعية حيث DN1a وب تتوافق مع الأسلاف الغدة الصعترية في وقت مبكر (ETP). Thymocytes إعادة ترتيب TCR δ، β α والسلاسل في مرحلة DN وتخضع قبل TCR اختيار (مراحل DN3-DN4). انهم عبور أخرى إلى CD4 + CD8 + إيجابية مزدوج (DP) حجرة حيث تعيد ترتيب سلسلة α TCR قبل سيلي الإيجابية والسلبيةction. في هذه المرحلة يتم استبعاد معظم thymocytes وفقط نسبة صغيرة (3-5٪) تصل إلى CD4 + أو CD8 + T مقصورة تنضج الخلية.
تمايز مسار اللمفاوية تقدم من خلال مراحل HSCs التي تولد الأسلاف متعدد القدرات (MPP) والأسلاف معبي اللمفاوية متعددة القدرات (LMPP) التي فقدت كرات الدم الحمراء والنواء المحتملين 6. يتم تعريف LMPP ظاهريا بسبب عدم وجود علامات خلايا الدم متباينة (النسب السلبية، لين -)، والتعبير عن ج-كيت (CD117)، هيئة السلع التموينية، 1 وFlt3 / Flk2 (CD135) وعدم وجود مستويات ملحوظة من انترلوكين ( IL) -7 مستقبلات α سلسلة (IL-7rα أو CD127). LMPPs تمييز الى مزيد من الأسلاف المشتركة اللمفاوية (CLP) 7 أنه من خلال تلك المرحلة قد فقدت القدرة على توليد خلايا الدم النخاعي. CLP الاحتفاظ الخلايا اللمفاوية (B والخلايا التائية)، الخلايا القاتلة الطبيعية، DC والخلايا اللمفاوية الفطرية (ILC) المحتملة، وتختلف عن LMPP عن طريق التعبير عن CD127 وعدم وجود مستويات عالية من هيئة السلع التموينية-1.
على الرغم من أن طبيعة التوتة تسوية الأسلاف (TSP) قد نوقشت على نطاق واسع 8، أصبح من الواضح مؤخرا أن تغيير النمط الظاهري TSP، إمكانية التمايز وظيفة، في جميع أنحاء تنمية 9. أجرينا في التجارب المختبرية وفحوصات الجسم الحي لتوصيف TSP المعزولة FACS الخلية الفرز من أي E13 (الموجة الأولى) أو E18 (الموجة الثانية). الجنين الثقافات الجهاز الغدة الصعترية (FTOC) مع فصوص الغدة الصعترية المشع مستعمرة من قبل أعداد متساوية من E13 E18 والأسلاف، واضعا علامات النمط الخيفي مختلفة، سمح التالية ذريتهم في بيئة تنموية مماثلة وكشف خلية الخصائص الجوهرية، مختلفة بين كلا النوعين من الأسلاف. فصوص الغدة الصعترية التي استعمرتها إما E13 أو E18 TSP سمحت تنمية دون انتقاء بسبب المنافسة بين كل من الأسلاف. أظهر في الجسم الحي زرع فصوص الغدة الصعترية المستعمرة كذلك أن أيضا رانه ذرية ناضجة من E13 E18 وTSP دينا مختلف الخصائص البيولوجية في الجسم الحي. TSPs من الموجة الأولى تولد بسرعة خلايا T ولكن تؤدي إلى انخفاض أعداد αβ وγδ الخلايا التائية. بين هذا الأخير اكتشفنا Vγ5Vδ1 الخلايا الجذعية الظهارية T (DETC)، التي لها TCR ثابتة، تهاجر إلى البشرة حيث تمارس وظيفة في التئام الجروح ويتم إنتاجها فقط أثناء التطور الجنيني 10. في المقابل، TSP من الموجة الثانية يستغرق وقتا أطول لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا TCR + T وغير قادر على توليد DETC.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحليلين الرئيسية يمكن استخدامها لتحليل T تمايز الخلايا خارج الجسم الحي. الأكثر ذكرت مؤخرا هو شريك في ثقافة الأسلاف المكونة للدم مع خلايا انسجة BM، OP9، معربا عن بروابط من Noth1، دلتا مثل 1 أو 4 12. هذا الاختبار 2-D من السهل القيام بها، كفاءة عالية وحساسية، مما يسمح ل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بدعم من معهد باستور، INSERM، الوكالة الوطنية للبحوث وكالة الاستخبارات الوطنية (غرانت اللمفاويات ')، وإعادة إحياء برنامج الاستثمار في المستقبل و "لا دوري الدرجة مناهضة للسرطان".
Materials
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
| Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
| Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
- Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
- Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
- Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
- Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
- Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
- Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
- Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
- Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
- Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).
