Charakterisierung von Thymic Einschwingzeit Vorläufern in der Mouse Embryo Verwendung<em> In Vivo</em> Und<em> In-vitro-</em> Assays
Summary
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Abstract
Charakterisieren Thymus Absetzen Vorläufern ist wichtig, die pre-Thymus Stufen T-Zell-Entwicklung zu verstehen, wesentlich, Strategien für T-Zell-Ersatz in lymphopenischen Patienten zu erstellen. Wir untersuchten Thymus Beilegung Vorläuferzellen aus murinen embryonalen Tag 13 und 18 Thymi durch zwei komplementäre in vitro und in vivo-Techniken, die beide auf der Grundlage des "hängenden Tropfen" Methode. Diese Methode erlaubt besiedeln bestrahlten fetalen Thymus Keulen mit E13 und / oder E18 Thymus-Vorläuferzellen durch CD45 allotypische Marker und damit im Anschluss an ihre Nachkommen aus. Colonization mit gemischter Bevölkerung ermöglicht die Analyse Zell autonomen Unterschiede in biologischen Eigenschaften der Vorläuferzellen während Besiedlung mit entweder Bevölkerung beseitigt mögliche Wettbewerbsselektionsdruck. Die Kolonisierten Thymus Lappen kann auch in immundefizienten männlichen Empfängermäuse ermöglicht die Analyse der reifen T-Zellen-Nachkommen in vivo, wie Populationsdynamik von t aufgepfropft werdener peripheren Immunsystem und Besiedlung von verschiedenen Geweben und Organen. Fötalem Thymus-Organkulturen zeigte, dass E13 Vorläufern entwickelt sich rasch in alle reifen CD3 + Zellen und führten zu der kanonischen γδ T-Zell-Untergruppe, wie dendritische epithelialen T-Zellen bekannt. Im Vergleich dazu haben E18 Vorläuferzellen eine verzögerte Differenzierung und konnten dendritische epithelialen T-Zellen zu erzeugen. Die Überwachung der peripheren Blut von Thymus-gepfropft CD3 – / – Mäuse zeigten weiter, dass E18 Thymus Beilegung Vorläuferzellen zu erzeugen, mit der Zeit, eine größere Anzahl von reifen T-Zellen als ihre Gegenstücke E13, eine Funktion, die nicht in der kurzen Frist fetalen Thymus geschätzt werden konnte Organkulturen.
Introduction
T-Lymphozyten, wobei das αβ oder γδ T-Zell-Rezeptor (TCR), differenzieren in einem speziellen Organ, der Thymus. Die ausgereifte Thymus ist in zwei unterschiedliche Bereiche unterteilt: die Rinde, in der Thymus-Vorläuferzellen entwickeln und wo Thymozyten, die produktiv TCR β und α-Kette-Gene neu anordnen aus programmierten Tod (ein Verfahren, wie die positive Selektion bekannt) gerettet; und der Medulla, wo ausgewählt Thymozyten mit zu starke Reaktivität Selbstliganden werden gelöscht (negative Selektion) 1,2. Der Thymus stammt aus dem endodermalen Schicht der dritten Schlundtasche, die später von mesenchymalen Zellen 3 umgeben ist. Es wird von hämatopoetischen Vorläuferzellen ab Embryonaltag E12, und danach wird eine kontinuierliche Einstellung für den normalen T-Zell-Entwicklung 4 erforderliche besiedelt. Thymus Einwanderer entwickeln durch aufeinanderfolgende Entwicklungsstadien, von einem streng regulierten Programm, initiiert und inszeniert maidurch die Aktivierung des Notch-Signalwegs auf Thymocyten bei Wechselwirkung mit seinem Liganden, wie 4 delta ntained, ausgedrückt Thymusepithelzellen (TECs) 5.
Thymozyten-Entwicklung beginnt bei der so genannten CD4 – CD8 – doppelt negativ (DN) Stufen. , DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) und DN4 (CD25 – CD44 -) – DN Thymozyten kann weiter gemäß der Expression von CD25 und CD44 in DN1 (CD44 + CD25) unterteilt werden. CD24 (HSA) und CD117 (c-Kit) weiter unterteilt die DN1 Fach in 5 Untergruppen, wo DN1A und b entsprechen frühen Vorläuferzellen des Thymus (ETP). Thymozyten neu anordnen TCR δ, β und α-Ketten an der DN Bühne und pre-TcR Auswahl (DN3-DN4 Stufen) zu unterziehen. Sie Transit auf die CD4 + CD8 + doppelt positiven (DP) Fach, in dem der TCR α-Kette lagert sich vor der positiven und negativen selection. In dieser Phase am meisten Thymozyten eliminiert werden und nur ein kleiner Anteil (3-5%) zu erreichen, die den CD4 + oder CD8 + T-Zellen zu reifen Fach.
Die lymphatischen Differenzierungsweg schreitet durch die Stadien der HSCs, die multipotenten Vorläuferzellen (MPP) und lymphatischen grundiert multipotenten Vorläuferzellen (LMPP), die die Erythrozyten und Megakaryozyten Potential 6 verloren zu generieren. LMPP phänotypisch durch das Fehlen von differenzierten Blutzellmarker definiert (Linie negativ, Lin -), die Expression von c-Kit (CD117), Sca-1 und Flt3 / Flk2 (CD135) und das Fehlen von nachweisbaren Konzentrationen an Interleukin ( IL) -7-Rezeptor-α-Kette (IL-7rα oder CD127). LMPPs weiter zu differenzieren, die in Stamm lymphatischen Vorläuferzellen (CLP) 7, dass von diesem Zeitpunkt haben die Fähigkeit, myeloischen Zellen erzeugen verloren. CLP behalten Lymphozyten (B- und T-Zelle), NK-Zelle DC und angeborenen lymphoiden Zelle (ILC) Potential, und unterscheiden sich von LMPP durch die Expression von CD127 und das Fehlen von hohen Sca-1.
Obwohl die Art der Thymus Beilegung Vorläuferzellen (TSP) wurde ausgiebig diskutiert 8, vor kurzem wurde klar, dass TSP Änderung Phänotyp, Differenzierungspotenzial und Funktion, während der gesamten Entwicklung 9. Wir führten in vitro und in vivo-Tests, um die TSP, durch FACS-Zellsortierung entweder von E13 (erste Welle) oder E18 (zweite Welle) isoliert kennzeichnen. Fetalen Thymus Organkulturen (FTOC) mit bestrahlten Thymus Lappen kolonisiert durch die gleiche Anzahl von E13 und E18 Vorläuferzellen, die verschiedene allotypische Marker, im Anschluss an ihre Nachkommen in einer ähnlichen Entwicklungsumgebung erlaubt und offenbarte Zelle innewohnenden Eigenschaften, unterschiedlich zwischen beiden Arten von Vorläuferzellen. Thymus Lappen entweder E13 oder E18 TSP kolonisiert erlaubt Entwicklung ohne Selektion aufgrund der Konkurrenz zwischen den beiden Vorläufern. In vivo Transplantation der kolonisierten Thymus Lappen weiter gezeigt, dass auch ter reifen Nachkommen von E13 und E18 TSP haben unterschiedliche biologische Eigenschaften in vivo. FDA von der ersten Welle schnell generieren T-Zellen, sondern führen zu geringen Anzahl von αβ und γδ T-Zellen. Unter den letzteren entdeckten wir Vγ5Vδ1 dendritischen epithelialen T-Zellen (DETC), die eine Invariante TcR, wandern in die Epidermis, wo sie eine Funktion, bei der Wundheilung ausüben und werden nur während der Embryonalentwicklung 10 hergestellt haben. Im Gegensatz dazu TSP aus der zweiten Welle zu nehmen längere Zeit, um eine hohe Zahl von TcR + T-Zellen zu erzeugen und sind unfähig, DETC generieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zwei Assays können verwendet werden, um T-Zell-Differenzierung ex vivo zu analysieren. Die zuletzt gemeldet ist die Co-Kultur von hämatopoetischen Vorläuferzellen mit BM-Stromazellen, OP9, Expression der Liganden der Noth1, delta wie 1 oder 4 12. Das 2-D-Assay ist leicht durchzuführen, sehr leistungsfähig und empfindlich, so dass bei Analyse Einzelzellebene. Es wird jedoch weder unterstützt T-Zell-Entwicklung über die Stufe der DP noch die Erzeugung von γδ DETC 13, die beide eine …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt durch das Institut Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant Lymphopoese '), der REVIVE Zukunftsinvestitionsprogramm und "La Ligue contre le Cancer".
Materials
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
| Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
| Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
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