Caracterización de tímico Instalarse Progenitores en el embrión de ratón Uso<em> En Vivo</em> Y<em> In Vitro</em> Ensayos
Summary
This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.
Abstract
La caracterización del timo resolver progenitores es importante comprender las etapas de pre-timo de desarrollo de las células T, esencial para diseñar estrategias para el reemplazo de las células T en pacientes lymphopenic. Estudiamos timo resolver progenitores desde el día embrionario murino 13 y 18 timos por dos complementarios in vitro e in vivo técnicas, ambos basados en el método de la "gota colgante". Este método permitió colonizar lóbulos tímicos fetales irradiados con E13 y / o E18 progenitores timo que se distinguen por CD45 marcadores alotípicos y por lo tanto después de su progenie. La colonización con poblaciones mixtas permite analizar las diferencias autónomas celulares en propiedades biológicas de los progenitores, mientras que la colonización, ya sea con la población elimina posibles presiones selectivas competitivos. Los lóbulos tímicos colonizados también pueden ser injertados en ratones receptores masculinos inmunodeficientes que permiten el análisis de la madura progenie de células T in vivo, como la dinámica de la población de tél periférica sistema inmunológico y colonización de diferentes tejidos y órganos. Cultivos de órganos del timo fetal revelaron que los progenitores E13 desarrollaron rápidamente en todos maduran las células CD3 + y dieron lugar al subconjunto de células T γδ canónica, conocidas como células T epiteliales dendríticas. En comparación, los progenitores E18 tienen una diferenciación retardada y no fueron capaces de generar células epiteliales T dendríticas. El seguimiento de sangre periférica de timo-injertado CD3 – / – ratones mostró además que los progenitores E18 tímico de sedimentación generan, con el tiempo, un mayor número de células T maduras que sus contrapartes E13, una característica que no se pudo apreciar en el corto plazo del timo fetal cultivos de órganos.
Introduction
Linfocitos T, que lleva el αβ o γδ receptor de células T (TCR), se diferencian en un órgano especializado, el timo. El timo plenamente desarrollado está organizado en dos regiones distintas: la corteza, donde se desarrollan los progenitores del timo y en timocitos que productivamente reorganizan los β TCR y genes de la cadena α son rescatados de la muerte programada (un proceso conocido como selección positiva); y la médula, donde selecciona timocitos con demasiado fuerte reactividad a auto-ligandos se borran (selección negativa) 1,2. El timo se origina en la capa endodérmico de la tercera bolsa faríngea que más tarde se encuentra rodeada por las células mesenquimales 3. Se colonizada por progenitores hematopoyéticos a partir de día embrionario E12 y, a partir de entonces, se requiere el reclutamiento continuo para el desarrollo de células T normales 4. Inmigrantes tímicos evolucionan a través de sucesivas etapas de desarrollo, orquestada por un programa estrictamente regulados, iniciado y maintained por la activación de la vía de señalización Notch en los timocitos tras la interacción con su ligando, como delta 4, expresado en las células epiteliales del timo (TEC) 5.
Desarrollo de los timocitos comienza en la llamada CD4 – CD8 – (DN) etapas doble negativos. Timocitos DN pueden subdividirse de acuerdo con la expresión de CD25 y CD44 en DN1 (CD25 – CD44 +), DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) y DN4 (CD25 – CD44 -). CD24 (HSA) y CD117 (c-Kit) subdivide aún más el compartimento DN1 en 5 subgrupos donde DN1A ayb corresponden a los progenitores tímicas tempranas (PTE). Timocitos reorganizar las δ, β y α cadenas de TCR en la etapa de DN y se someten a pre-TcR selección (etapas DN3-DN4). Ellos aún más el tránsito a la doble positivo (DP) compartimento CD4 + CD8 + en la cadena α TcR reorganiza antes de la sele positivo y negativocción. En esta etapa la mayoría de los timocitos se eliminan y sólo un pequeño porcentaje (3-5%) llegan a la CD4 + o CD8 + T maduras compartimento celular.
La vía de diferenciación linfoide progresa a través de las etapas de las CMH que generan progenitores multipotentes (MPP) y progenitores multipotentes linfoides cebado (LMPP) que perdieron la eritrocitos y megacariocitos potencial 6. LMPP son fenotípicamente define por la ausencia de marcadores de células de la sangre diferenciadas (linaje negativo, Lin -), la expresión de c-Kit (CD117), Sca-1 y Flt3 / Flk2 (CD135) y la ausencia de niveles detectables de la interleucina ( IL) -7 receptores α cadena (IL-7rα o CD127). LMPPs diferenciar aún más en progenitores linfoides comunes (CLP) 7 que por esa etapa han perdido la capacidad de generar células mieloides. CLP retener de linfocitos (B y células T), células NK, DC y células linfoides innata (ILC) potencial, y difieren de LMPP por la expresión de CD127 y la ausencia de altos niveles de Sca-1.
Aunque la naturaleza de los progenitores del timo de sedimentación (PST) se ha debatido ampliamente 8, que recientemente se convirtió en claro que el cambio TSP fenotipo, el potencial y la función de la diferenciación, a través del desarrollo 9. Se realizó in vitro y en ensayos in vivo para caracterizar el TSP, aislado por FACS de células de clasificación de cualquiera de E13 (primera onda) o E18 (segunda onda). Culturas timo fetales de órganos (FTOC) con lóbulos tímicos irradiados colonizados por un número igual de E13 y E18 progenitores, teniendo diferentes marcadores alotípicos, se admiten después de su progenie en un entorno de desarrollo similar y reveladas propiedades intrínsecas celulares, diferentes entre ambos tipos de progenitores. Lóbulos tímicos colonizados por cualquiera E13 o E18 TSP permite el desarrollo sin la selección debido a la competencia entre ambos progenitores. In vivo el trasplante de los lóbulos tímicos colonizados mostró además que también tque la progenie madura de E13 y E18 TSP tiene diferentes propiedades biológicas in vivo. TSP de la primera ola generan rápidamente las células T, pero dan lugar a un bajo número de αβ y γδ células T. Entre estos últimos se detectaron células dendríticas Vγ5Vδ1 epiteliales T (LTED), que tienen un TcR invariante, migrar a la epidermis donde ejercen una función en la cicatrización de heridas y sólo se producen durante el desarrollo embrionario 10. Por el contrario, TSP de la segunda ola de tomar más tiempo para generar un gran número de células T TcR + y son incapaces de generar DETC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dos ensayos principales pueden ser utilizados para analizar la diferenciación de células T ex vivo. El es la más reciente informó el co-cultivo de células progenitoras hematopoyéticas con células estromales de BM, OP9, expresando los ligandos de Noth1, delta como 1 o 4 12. Este ensayo 2-D es fácil de realizar, altamente eficiente y sensible, lo que permite el análisis en el nivel de células individuales. Sin embargo, no apoya el desarrollo de células T más allá de la etapa de DP ni la ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoyado por el Instituto Pasteur, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant 'linfopoyesis'), el Programa de Inversión REVIVE Futuro y "La Ligue contre le Cancer".
Materials
| 90 x 15 mm and 35 x 15 mm plastic tissue culture petri dishes. | TPP | T93100/T9340 | Sampling |
| 26GA 3/8 IN 0.45x10mm syringes with needles Beckton-Dickinson Plastipak. | BD Plastipak | 300015 | Cell suspension |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized 50/50 mm pieces. | SEFAR NITEX | 03-100/32 | Filtration of cells |
| Ethanol 70%. | VWR | 83801.36 | Sterility Actions |
| Iodide Povidone 10% (Betadine) | MEDA Pharma | 314997.8 | Sterility Actions |
| Ketamine 100mg/ml (stock solution) | MERIAL | - | Anesthesic |
| Xylazine 100mg/ml in PBS (stock solution) | Sigma | X1251-1G | Anesthesic and muscle relaxant |
| Buprenorphin 0.3mg/ml stock solution | AXIENCE | - | Morphinic analgesic |
| Ophtalmic gel (0.2% cyclosporin) | Schering-Plough Animal Health | - | Eyes protection |
| DPBS (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 14040-174 | to isolate embryos |
| HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2) | GIBCO Life Technology | 24020-091 | to wash out the blood and dissect the embryos |
| OPTI-MEM I GlutaMAX I | GIBCO Life Technology | 51985-026 | Medium for cultures |
| Fœtal Calf serum | EUROBIO | CVFSVF00-0U | additive for cultures |
| Penicilin and Streptomycin | GIBCO Life Technology | 15640-055 | Antibiotics for cultures |
| 2 b mercapto ethanol | GIBCO Life Technology | 31350010 | additive for cultures |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Two goose neck fibers adapted |
| Silicone elastomer | World Precision Instruments | SYLG184 | Dissecting Pad |
| Spoon, round and perforated | Fine Science Tools | 10370-18 | Dissection tools |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Vannas spring Scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | Dissection tools |
| Forceps : Dumont #5/45 Inox 11 cm | F.S.T. | 11253-25 | Dissection tools |
| Two pairs of fine straight watchmakers’ forceps Dumont #5 11 cm fine tips. | Fine Science Tools | 11295-20 | Dissection tools |
| Polyamid thread with needle 6-0 C-3 3/8c | ETHICON | F2403 | for sutures |
| Needle-holder | MORIA/F.S.T. | 12060-02 | for sutures |
| Heating pad | VWR | 100229-100 | To maintain mouse temperature during anesthesy |
| Membrane Isopore RTTPO2500 | DUTSCHER | 44210 | For FTOC |
| Terasaki 60 wells plates | FISHER | 1×270 10318801 | For hanging drop technique |
| Gauze swabs steriles 7.5cmx7.5cm | Hydrex | 11522 | To apply disinfecting solution |
| Fluorescence or biotin labelled antibodies | BD Biosciences, Biolegend or e-Biocsiences | Clone Number see table below | Staining cells |
| MACS Columns/Streptavidin Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-042-401/130-048-101 | Cell depletion |
| Mice | Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs (CD45.2) | C57BL/6 CD45.1 OR CD45.2 | Source of cells and thymic lobes |
| Mice | CDTA Orléans, France | CD 3 epsilon Ko CD45.2 | Grafting experiment |
References
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