Planar Gradient Diffusion System Chemotaxis onderzoeken in een 3D collageenmatrix

Summary

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

Abstract

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Introduction

De geprefereerde beweging van cellen naar een concentratiegradiënt, bekend als chemotaxis, speelt een belangrijke rol bij pathologische en fysiologische processen in het lichaam. Dergelijke voorbeelden zijn huid en slijmvliezen wondgenezing ^1, morfogenese ^{2, 3} ontsteking en tumorgroei ^4,5. Ook is aangetoond dat kankercellen kunnen migreren door zowel individuele als collectieve cel migratiestrategieën ^6. Bovendien kan instabiliteit diffusie mechanismen scheiding van enkele of geclusterde cellen van een tumor die / object induceren en dan kan immigratie naar een bron van voedingsstoffen en dus binnendringen grotere gebieden en weefsels ^7.

Bovendien is aangetoond dat diverse migratiemechanismen actief kunnen zijn in 2D en 3D, vanwege verschillende rollen van adhesiemoleculen ^8. Daarom is een verhuizing naar fysiologisch relevante in vitro assays om celbeweeglijkheid te onderzoeken in een measureable en eenvoudige manier van belang is bij het ​​begrijpen van de cel beweging verschijnselen ^9. Helaas, de moeilijkheid bij het analyseren van celmigratie, een uitgebreide kwantificeerbare chemotaxis assay vereist meestal een lange moeizame methode, gebaseerd op de meting van onpartijdig celmotiliteit en transport verschijnselen modellen.

Past experimentele benaderingen naar cel chemotaxis onderzoeken onder meer de Boyden kamer ¹⁰ en de onder agaroseanalyse ^11. Echter, in deze vroege assays, celmigratie experimenten niet de beweging met betrekking tot tijd te controleren. More, belangrijker, de concentratie gradiënten voor de experimenten waren niet goed gedefinieerd of volledig begrepen terwijl slechts het behoud van de signalering niet meer dan een paar uur. Bovendien vroeg chemotaxis kamer pogingen beperkt cel migratie naar twee dimensies en niet toestaan ​​dat de ene naar de kinetiek van migratie ¹² bewaken. Kijkend naar de Boyden kamer, een eindpunt assayzou niet toestaan ​​dat de onderzoeker migratie visueel observeren en kon niet direct onderscheid chemotaxis (directionele beweging) van chemokinesis (random beweging). Bovendien zijn een aantal variabelen-verschillen in de porie grootte en dikte van de membranen-maakte de kamer zeer moeilijk om gemakkelijk te reproduceren en verborgen de migrant reactie van cellen om chemokines ^13,14.

Met het nieuwe begrip van microfluidics, hebben nieuwe kamers en micro-apparaten onderzocht als een instrument om mobiele motoriek onder interstitiële stroom omstandigheden te onderzoeken of chemotaxis ^15,16. Onder deze nieuwe apparaten, werden nieuwe cel metrics geïntroduceerd en onderzocht, zoals het effect van shear stress op een mobiele ^17,18. Helaas, het verleden en de huidige microfluïdische chemotaxis kamers beperkt studies van de cel migratie naar 2D-substraten een belangrijke tegenslag omdat veel biologische processen, met inbegrip van de tumorcel invasie en metastase, en immune celmigratie, betrekken 3D migratie.

Directe observatie-kamers waar chemoattractant oplossing in contact met een 3D gel met cellen zijn eveneens ook gemeld ^19,20. Deze kamers hebben twee compartimenten, een met een chemoattractant en één bevattende cellen zijn verbonden naast elkaar horizontaal ²¹ of concentrische ringen ^22. Deze systemen worden aangegeven in de juiste richting, maar geen chemotaxis systeem houdt gedurende langere tijd.

Daarnaast hebben onderzoekers ook onderzocht door middel van diffusie collageenmembranen in dialyse-cellen, alsook de diffusie van tracer moleculen door collageen monsters onderworpen aan hydrostatische druk ^23-25. Sommige diffusie experimenten collageen gels afhankelijk fysische en chemische modificaties van de gel met behulp van magnetische velden en chemische incorporatie ^26. Een populaire methode voor het modelleren van diffusiviteit in collaGenous weefsels gebaseerd op de fluorescentie beeldvorming van continue punt fotobleken. Deze werkwijze is geopenbaard anisotropie in de diffusie coëfficiënten van macromoleculen in georiënteerde collagene weefsels. Toch is fotobleken gebruikt in gewrichtskraakbeen en niet-collageen matrices. Terwijl soortgelijke dienen de nodige modelleren experimenten doorgevoerd specifiek begrip van de diffusiecoëfficiënt van collageen gels. Wat nog belangrijker is, zijn de systemen niet een methode voor het meten van mobiele troepenmacht benutten.

Helaas zijn de meeste systemen lijken te ontbreken een of twee belangrijkste elementen voor een ideaal systeem: het toestaan ​​van cell tracking, een diffusie gradiënt begrip met een chemotactische factor door de matrix, een relatief eenvoudige set-up met een gemak van de reproduceerbaarheid, het minimaliseren van cel-cel interacties, en het vermogen om dimensionele eenheden voor het kwantificeren (bijvoorbeeld snelheid, kracht, specifieke concentratie) te meten. Møghe et al. </em> ²⁷ voorgesteld een systeem dat de meeste van deze eisen waarbij cellen oorspronkelijk werden gedispergeerd door de gel in plaats gericht op het filteroppervlak voldaan, maar was moeilijk krachten die de cel genereert meten.

Hiervoor presenteren we een vlakke gradiënt diffusiesysteem chemotaxis onderzoeken 3D collageenmatrix, waarmee men moderne diffusiekamer beperkingen van bestaande assays, die is gebaseerd op time-lapse microscopie, samen met beeldanalyse technieken om cellen te meten overwinnen krachten in een 3D-omgeving. Dit protocol is een eenvoudige, maar innovatieve manier om een ​​eenvoudige 3D diffusiekamer die kunnen worden gebruikt om 3D chemotaxis in verschillende cellen te onderzoeken.

Protocol

1. 3D-Mold ontwerp en Onderdelen Schimmel Voor het werken, het verkrijgen van een siliconenelastomeer kit, een live-cell imaging kamer, een 22 mm glazen dekglaasje en een bewerkte aluminium metalen kubus met afmetingen 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Bereid de live cell imaging kamer te vormen door het plaatsen van het dekglaasje in de onderste houder en monteren van de rest van de kamer overeenkomstig de door de leverancier. Vervolgens, met behulp van een tang, plaatst u de bewerkte aluminiu…

Representative Results

Het vermogen van de test om de migratie van de cellen nauwkeurig te beoordelen vertrouwt op een goede opzet van het systeem. Daarom is het essentieel voor zorgen dat het diffusiesysteem matrijs nauwkeurig ontwerpen en grote zorg in het plaatsen van hydrofobe en hydrofiele dekglaasjes, zie figuur 1. Als het systeem goed ontworpen en tijdens de diffusie modelleringsfase zorgen voor een voorbeeld goede lineaire startlijn, men in staat fijn bereiken fluoresceert beelden, zoals weergegeven in figuur …

Discussion

De meest kritische stappen voor een succesvolle diffusie experimenten met of zonder cellen zijn: juist het opzetten van de mal vergadering; ontwikkeling van de benodigde handigheid om schade tijdens de extractie van hydrofobe dekglaasjes voorkomen; zorgen voor een zeer goede lineair startlijn te kunnen berekenen van de diffusiecoëfficiënt vinden; experimentele berekeningen van zowel collageen en chemoattractant corrigeren; correct gebruik van live cell imaging systeem om matrix zorgen niet uitdroogt; en onderhouden va…

Materials

Silicone elastomer kit	Dow Corning Corp	182 SIL ELAST KIT .5KG	a two-part misture with a 10:1 mix
Live cell imaging chamber	Live Cell Instrument	CM-B18-1	CMB for 18mm round coverslips
22mm Glass Coverslip	Fisher Scientific	NC0180281	Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5
Machined aluminum metal cube
Hobby utility knife	X-Acto	X3201
3-(aminopropyl) trimethoxysilane	Sigma-Aldrich	281778-5ML
Glutaraldehyde	Polysciences, Inc	00216A-10	Glutaraldehyde, EM Grade, 8%
50 ml tube	Fisher Scientific	14-432-22	Standard floor model and tabletop centrifuges
Glass petri dish	Fisher Scientific	08-747A	Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm)
Forceps	Fisher Scientific	22-327-379	Fine Point Forceps
Cover glasses	Fisher Scientific	12-518-105A	Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl	Gelest	SIT8174.0
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099	Acetic acid ACS reagent, ≥99.7%
Hexane	Sigma-Aldrich	296090	Hexane
			anhydrous, 95%
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof, for molecular biology
High-precision diamond scribing tool	Lunzer	PV-081-3	Straight extended tip scribe, .020" (.50mm) diameter by .200" (5.0mm) tip length
Vacuum grease	Dow Corning	14-635-5C	High-Vacuum Grease
15 ml tube	Fisher Scientific	14-959-49D	15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface
10X phosphate buffered solution	Fisher Scientific	BP399-500	1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer
1N sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	38215	Sodium hydroxide concentrate
Collagen I, rat tail	BD Biosciences	354236	Rat tail
Micro centrifuge tube	Fisher Scientific	02-681-332	Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped
Carboxylate-modified microspheres	Invitrogen	F-8813	Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids
Rhodamine	Sigma-Aldrich	83689	Rhodamine B for fluorescence