Planar Gradient Difüzyon Sistemi 3D Kollajen Matrix Kemotaksis Araştırma
Summary
Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.
Abstract
The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.
Introduction
kemotaksisi olarak bilinen bir konsantrasyon gradyanı doğru hücrelerinin tercih edilen bir hareketi, vücut patolojik ve fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar. Bu gibi örnekler, deri ve mukoza yara iyileşmesi, 1 morfogenez 2, iltihap 3 ve tümör büyümesi 4,5 bulunmaktadır. Aynı zamanda kanser hücreleri hem bireysel hem de kolektif hücre göç stratejilerinin 6 doğru göç edebildiğini ortaya konmuştur. Ayrıca, difüzyonel istikrarsızlık mekanizmaları besin kaynağına doğru göç ve dolayısıyla daha geniş alanları ve dokuları 7 istila edebilir sonra bir tümörlü beden / nesneden tek veya kümelenmiş hücrelerin ayrılmasını teşvik edebilirsiniz.
Ayrıca, çeşitli göç mekanizmaları nedeniyle adezyon moleküllerinin 8 farklı roller, 2D ve 3D aktif olabileceği gösterilmiştir. Bu nedenle, in vitro tayinlerde fizyolojik ilgili bir hareket, bir measureabl hücre hareketliliğini araştırmak içinE ve basit bir şekilde hücre hareketi fenomeni 9 anlamada önem taşımaktadır. Ne yazık ki, hücre göçü analiz zorluk, kapsamlı ölçülebilir kemotaksi deneyi genellikle tarafsız hücre hareketi ve ulaşım olayları modellerinin ölçümü üzerine kurulmuş uzun zahmetli bir yöntem gerektirir.
Hücre kemotaksisini araştırmak için Geçmiş deneysel yaklaşımlar Boyden haznesi 10 ve under agaroz tahlil 11 arasındadır. Bununla birlikte, bu ilk deneylerde, hücre göçü deneyleri zamana göre hareketi izlemek yoktu. Daha da önemlisi, deneyler için kullanılan konsantrasyon gradyanlar iyi tanımlanmış değil veya sadece birkaç saat fazla için sinyalizasyon sürdürülmesi sırasında tam olarak anlaşılamamıştır. Ayrıca, erken kemotaksis odasının girişimleri iki boyutlu hücre göçü kısıtlı ve bir göç 12 kinetiği izlemek için izin vermedi. Boyden odasının baktığımızda, bir uç nokta deneyiAraştırmacı görsel göç gözlemlemek için izin vermez ve doğrudan kemokinezinin (rastgele hareket) den kemotaksis (yönlü hareket) ayırt edemedi. Buna ek olarak, gözenek boyutu ve kalınlığı birkaç değişken-farklar kolayca üretmek için çok zor odasını membranların yapımı ve kemokinlere 13,14 hücrelerin göçmen tepkisini gizli.
Mikroakiskan yeni anlayışla, yeni odaları ve mikro cihazlar interstisyel akış koşulları altında hücre lokomosyon araştırmak için bir araç olarak incelenmiştir veya 15,16 kemotaksis oylandı. Bu yeni cihazlar altında, yeni hücre ölçümlerini tanıtıldı ve bir hücre 17,18 üzerinde kayma gerilmesi etkisi gibi, incelendi. Ne yazık ki, geçmiş ve şimdiki mikroakışkan kemotaksis odaları tümör hücre invazyonu ve metastaz, ve im de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçler, çünkü 2B yüzeyler-önemli bir gerileme hücre göçü çalışmalar sınırlıbağışıklık hücre göçü, göç 3D içerir.
Doğrudan gözlem odaları-burada bir kemoatraktanttır çözeltisi hücreleri ihtiva eden bir 3 boyutlu jel ile temas halinde olan, aynı zamanda, aynı zamanda 19,20 bildirilmiştir. Bu odalar yatay birbirlerine 21 yanında veya konsantrik halkalar 22 olarak birleştirilmiş, iki bölmeleri, bir kemoatraktan içeren bir ve hücreleri içeren bir tane var. Bu sistemler doğru yöne, ancak uzun bir süre için bir kemotaksis sistemi tutmuyorum.
Bundan başka, araştırmacılar da diyaliz hücreleri, hem de hidrostatik basınç 23-25 tabi kolajen örnekler aracılığıyla izleyici moleküllerinin difüzyonuna kolajen zarları aracılığıyla yayılma inceledik. Kollajen jel bazı difüzyon deneyleri manyetik alanlar ve kimyasal birleşme 26 kullanılarak jel fiziksel ve kimyasal değişiklikler dayanır. Colla içinde yayılma modellemek için popüler bir yöntemotojen dokular sürekli nokta photobleaching floresan görüntüleme dayanır. Bu yöntem odaklı kollajenoz dokularda makromoleküllerin difüzyon katsayılarında anizotropiye ortaya koymuştur. Oysa, photobleaching eklem kıkırdağı kullanılır ve matrisleri kollajen edilmiştir. Benzer birlikte, gerekli olan modelleme deneyleri özellikle kollajen jel difüzyon katsayısı anlama yoluyla yapılması gerekir. Daha da önemlisi, sistem, hücre gücü üretimi ölçmek için bir yöntem kullanmaktadır yoktur.
Ne yazık ki, çoğu sistem için ideal bir sistem için bir ya da iki temel unsuru eksik gibi görünüyor: Hücre izleme, matris tekrarlanabilirliği bir kolaylığı ile nispeten basit bir set up, en aza indirilmesi yoluyla kemotaktik faktörü ile difüzyon degrade anlayışının izin etkileşimler hücre-hücre ve boyutsal ölçümü için birimler (örneğin, hız, kuvvet, belirli konsantrasyon) ölçmek için yeteneği. Moghe ve diğ. </em> 27 hücreleri başlangıçta jel boyunca dağınık ziyade filtre yüzeyinde konsantre edildiği, bu gereksinimleri en yerine bir sistem önerdi, ancak hücre üretir kuvvetleri ölçmek için zordu.
Bu amaçla, biz bir hücreyi ölçmek için görüntü analiz teknikleri ile birleştiğinde time-lapse mikroskopi dayalı mevcut deneyleri, modern yayılma odası sınırlamaları aşmak için izin veren bir 3D kollajen matriks içinde kemotaksis araştırmak için bir düzlemsel degrade difüzyon sistemi sunuyoruz 3 boyutlu bir ortamda kuvvetler. Bu protokol, farklı hücrelerde 3D kemotaksis araştırmak için kullanılabilecek basit bir 3D difüzyon odasını oluşturma basit ama yenilikçi bir yol sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
veya hücrelerin olmadan başarılı difüzyon deneyleri için en kritik adımlar şunlardır: doğru kalıp düzeneğini kurma; hidrofobik lamelleri çıkarılması sırasında zarar görmesini önlemek için gerekli el becerisi geliştirme; doğru difüzyon katsayısını hesaplamak için çok iyi bir doğrusal başlangıç çizgisine bulmak için sağlanması; kollajen ve kemoatraktan hem deneysel hesaplamalar düzeltmek; Doğru kurumaz matris sağlamak için canlı hücre görüntüleme sisteminin kullanımı;…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Drs. Jonathan Reichner and Angle Byrd for cell experiment insight. The National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (GRFP) supported this work.
Materials
| Silicone elastomer kit | Dow Corning Corp | 182 SIL ELAST KIT .5KG | a two-part misture with a 10:1 mix |
| Live cell imaging chamber | Live Cell Instrument | CM-B18-1 | CMB for 18mm round coverslips |
| 22mm Glass Coverslip | Fisher Scientific | NC0180281 | Neuvitro Corp. cover slip 22mm 1.5 |
| Machined aluminum metal cube | |||
| Hobby utility knife | X-Acto | X3201 | |
| 3-(aminopropyl) trimethoxysilane | Sigma-Aldrich | 281778-5ML | |
| Glutaraldehyde | Polysciences, Inc | 00216A-10 | Glutaraldehyde, EM Grade, 8% |
| 50 ml tube | Fisher Scientific | 14-432-22 | Standard floor model and tabletop centrifuges |
| Glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747A | Reusable Petri Dishes: Complete (60 x 15mm) |
| Forceps | Fisher Scientific | 22-327-379 | Fine Point Forceps |
| Cover glasses | Fisher Scientific | 12-518-105A | Rectangle; 30 x 22mm; Thickness No. 1 |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl | Gelest | SIT8174.0 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Acetic acid ACS reagent, ≥99.7% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090 | Hexane |
| anhydrous, 95% | |||
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| High-precision diamond scribing tool | Lunzer | PV-081-3 | Straight extended tip scribe, .020" (.50mm) diameter by .200" (5.0mm) tip length |
| Vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5C | High-Vacuum Grease |
| 15 ml tube | Fisher Scientific | 14-959-49D | 15 ml conical centrifuge tubes with hydrophobic, biologically inert surface |
| 10X phosphate buffered solution | Fisher Scientific | BP399-500 | 1.37 M Sodium Chloride, 0.027 M Potassium Chloride, and 0.119 M Phosphate Buffer |
| 1N sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 38215 | Sodium hydroxide concentrate |
| Collagen I, rat tail | BD Biosciences | 354236 | Rat tail |
| Micro centrifuge tube | Fisher Scientific | 02-681-332 | Volume: 2.0 ml; O.D. x L: 13 x 40 mm; sterile; single-wrapped |
| Carboxylate-modified microspheres | Invitrogen | F-8813 | Carboxylate-modified microspheres, 0.5 µm, yellow-green fluorescent (505/515), 2% solids |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich | 83689 | Rhodamine B for fluorescence |
References
- Adzick, N. S. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. Ann Surg. 225 (2), 236 (1997).
- Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: an unconventional approach to isolation of first mammalian morphogens. Cytokine Growth F. R. 8 (1), 11-20 (1997).
- Coussens, , Werb, Z, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420 (6917), 860-867 (2002).
- Vital-Lopez, F. G., Armaou, A., Hutnik, M., Maranas, C. D. Modeling the effect of chemotaxis on glioblastoma tumor progression. AIChE J. 57 (3), 778-792 (2011).
- Hughes-Alford, S. K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of gradient sensing: towards building predictive models of chemotaxis in cancer. Curr. Opin. Cell Biol. 24 (2), 284-291 (2012).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nat. Rev. Mol Cell Bio. 10 (7), 445-457 (2009).
- Cristini, V. Morphologic Instability and Cancer Invasion. Clin. Cancer Res. 11 (19), 6772-6779 (2005).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Parent, C. A., Devreotes, P. N. A cell’s sense of direction. Science. 284 (5415), 765-770 (1999).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J. Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Rosoff, W. J., McAllister, R., Esrick, M. A., Goodhill, G. J., Urbach, J. S. Generating controlled molecular gradients in 3D gels. Biotechnol. Bioeng. 91 (6), 754-759 (2005).
- Wells, A., Kassis, J., Solava, J., Turner, T., Lauffenburger, D. A. Growth factor-induced cell motility in tumor invasion. Acta Oncol. 41 (2), 124-130 (2002).
- Wilkinson, P. C. Assays of leukocyte locomotion and chemotaxis. J. Immunol. Methods. 216 (1-2), 139-153 (1998).
- Bonvin, C., Overney, J., Shieh, A. C., Dixon, J. B., Swartz, M. A. A multichamber fluidic device for 3D cultures under interstitial flow with live imaging: development, characterization, and applications. Biotechnol. Bioeng. 105 (5), 982-991 (2010).
- Noo, L. J., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nat. Biotechnol. 20 (8), 826-830 (2002).
- Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9 (21), 3118-3125 (2009).
- Haessler, U., Kalinin, Y., Swartz, M. A., Wu, M. An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomed. Microdevices. 11 (4), 827-835 (2009).
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat. Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol. Biol. 769, 149-165 (2011).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J. Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J. Cell. Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
- Gilbert, D. L. Macromolecular diffusion through collagen membranes. Int. J. Pharm. 47 (1-3), 79-88 (1988).
- Ramanujan, S., et al. Diffusion and convection in collagen gels: implications for transport in the tumor interstitium. Biophys. J. 83 (3), 1650-1660 (2002).
- Weadock, K., Silver, F. H., Wolff, D. Diffusivity of 125I-calmodulin through collagen membranes: effect of source concentration and membrane swelling ratio. Biomaterials. 7 (4), 263-267 (1986).
- Erikson, A., Andersen, H. N., Naess, S. N., Sikorski, P., Davies, C. d. L. Physical and chemical modifications of collagen gels: impact on diffusion. Biopolymers. 89 (2), 135-143 (2008).
- Moghe, P. V., Nelson, R. D., Tranquillo, R. T. Cytokine-stimulated chemotaxis of human neutrophils in a 3-D conjoined fibrin gel assay. J. Immunol. Methods. 180 (2), 193-211 (1995).
- Sundd, P., et al. Live cell imaging of paxillin in rolling neutrophils by dual-color quantitative dynamic footprinting. Microcirculation. 18 (5), 361-372 (2011).
- Sanders, E. R. Aseptic Laboratory Techniques: Volume Transfers with Serological Pipettes and Micropipettors. J. Vis. Exp. (63), 2754 (2012).
- Stephenson, F. H. . Calculations for Molecular Biology and Biotechnology: A Guide to Mathematics in the Laboratory 2e. , (2010).
- Bar-Kochba, E., Toyjanova, J., Andrews, E., Kim, K., Franck, C. A Fast Iterative Digital Volume Correlation Algorithm for Large Deformations. Exp. Mech. In press, (2014).
- Shenoy, V., Rosenblatt, J. Diffusion of Macromolecules in Collagen and Hyaluronic Acid, Rigid-Rod-Flexible Polymer Composite Matrixes. Macromolecules. 28 (26), 8751-8758 (1995).
- Leddy, H., Guilak, F. Site-Specific Molecular Diffusion in Articular Cartilage Measured using Fluorescence Recovery after Photobleaching. Ann. Biomed. Eng. 31 (7), 753-760 (2003).
