Kupffer cellule d'isolement pour les essais de toxicité des nanoparticules

Summary

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

Abstract

La grande majorité des études in vitro de nanotoxicological ont utilisé des lignées cellulaires immortalisées pour leur praticité. Cependant, les résultats des tests de toxicité des nanoparticules dans des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires ont montré des anomalies, en soulignant la nécessité d'étendre l'utilisation de cellules primaires pour les essais in vitro. Ce protocole décrit l'isolement de macrophages hépatiques de souris, les cellules de Kupffer Nom de famille, ainsi que leur utilisation pour étudier la toxicité des nanoparticules. Les cellules de Kupffer population des macrophages sont les plus abondants dans le corps et constituent une partie du système réticulo-endothélial (RES), responsable de la capture des nanoparticules de circulation. La méthode d'isolement des cellules de Kupffer est question ici est basé sur une méthode de perfusion deux étapes suivi d'une purification sur gradient de densité. La méthode, basée sur la digestion de collagénase et une centrifugation de densité, est une adaptation du protocole d'origine développé par Smedsrød et al. conçu pour les cellules du foie de rat isolation et fournit un rendement élevé (jusqu'à 14 x 10 ⁶ cellules par souris) et de haute pureté (> 95%) des cellules de Kupffer. Cette méthode d'isolement ne nécessite pas d'équipements sophistiqués et coûteux ou représente donc un compromis idéal entre la complexité et le rendement de la cellule. L'utilisation de souris plus lourds (35 à 45 g) permet d'améliorer le rendement du procédé d'isolation, mais aussi facilite remarquablement le mode opératoire de canulation de la veine porte. La toxicité des nanotubes de carbone fonctionnalisés f -CNTs a été mesuré dans ce modèle par le dosage de la LDH modifié. Cette méthode évalue la viabilité des cellules en mesurant le manque d'intégrité structurelle de la membrane des cellules de Kupffer après incubation avec -CNTs f. Toxicité induite par -CNTs f peut être mesurée en utilisant systématiquement ce test, soulignant que les cellules de Kupffer isolées sont utiles pour les tests de toxicité des nanoparticules. La compréhension globale de la nanotoxicologie pourrait bénéficier de ces modèles, ce qui rend la sélection de nanoparticules pour la traduction clinique plus efficace.

Introduction

Le domaine de la recherche de la nanotoxicologie vise à caractériser l'effet biologique des nanoparticules. Les études toxicologiques basées sur des investigations in vivo restent les méthodes les plus précises. Toutefois, leur utilisation est limitée par leur coût, travail et temps exigences ^1. Comme essais alternatives, in vitro ont été utilisées en raison de leur simplicité et de la possibilité de développer à haut débit dans les plateformes de test in vitro ² – étendant ainsi le nombre de conditions testées. La plupart des études sont effectuées en utilisant nanotoxicological dans des essais in vitro sur des lignées de cellules immortalisées. Cependant, il ya des préoccupations concernant l'extrapolation de ces résultats expérimentaux à des effets toxicologiques in vivo ^3. En effet, les propriétés des lignées cellulaires immortalisées peuvent être significativement différents de tissus ils ont été dérivés à partir, par exemple, la transformation génétique ^4, la détérioration des caractéristiques morphologiques clés5, la perte de la polarité cellulaire ⁶ et altérations fonctionnelles telles que la réglementation des médiateurs inflammatoires ^7.

Les cellules de Kupffer population des macrophages sont les plus abondants dans le corps et sont directement en contact avec le sang en alignant la paroi de sinusoïdes hépatiques. Dans le cadre du système réticulo-endothélial (RES), les macrophages sont responsables de la capture des nanoparticules de circulation et, par conséquent, constituent un modèle très approprié pour étudier la toxicité des nanoparticules. In vivo ⁸ et in vitro ⁹ études de réponses inflammatoires associées à des cellules de Kupffer exposés à des nanoparticules ont été publiés ailleurs. Les cellules de Kupffer ont également été impliqués dans la pathogenèse des maladies du foie telles que la maladie alcoolique du foie ^10, la fibrose hépatique ou hépatite virale ^{11 12.} Il a été rapporté que les cellules de Kupffer isolés donnent un aperçu utile de décrire les mécanismes cellulaires involved dans la perturbation du foie ^13,14.

Plusieurs procédés ont été rapportés pour isoler et purifier des cellules de Kupffer. l'isolement cellulaire peut causer de la dissociation mécanique ou enzymatique ^15. Digestion collagénase montre l'intérêt de la conservation de l'intégrité fonctionnelle des cellules de Kupffer, tout en conduisant à haute Kupffer rendement de la cellule ^16. De nombreuses approches expérimentales différentes, la complexité et les coûts, ont été utilisées pour séparer les cellules de Kupffer les autres populations de cellules du foie. Par exemple, des cellules de Kupffer pureté peut être obtenue par immunoaffinite ^17, le flux ¹⁸ électrophorèse, l'adhérence sélective ¹⁶ ou par des techniques d'épandage ^16, qui sélectionnent les cellules selon leur taille et leur densité. Une combinaison de ces méthodes peut être choisie pour augmenter la pureté de la population ^16. Il n'y a pas de consensus sur la méthode idéale pour l'isolation des cellules de Kupffer, car elle dépend principalement sur les applications disponibles et équipemt. Toutefois, dans le cas des essais de toxicité de nanoparticules, la simplicité et un rendement élevé de la technique associée à la conservation fonctionnelle des cellules de Kupffer ont semblé être plus approprié pour cette application.

La méthode d'isolement des cellules de Kupffer est question ici est basé sur une méthode de perfusion deux étapes suivi d'une purification sur gradient de densité. Le procédé a été modifié par rapport au protocole initial développé par Smedsrød et al. ¹⁶ conçus pour l'isolement des cellules de foie de rat. La plupart des études ont rapporté et décrit l'isolement de cellules de Kupffer du foie de rat. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler les cellules de Kupffer du foie de la souris, avec un rendement élevé et de pureté. L'utilisation de souris réduit le coût de l'expérimentation et permet le traitement de plusieurs foies d'obtenir de grandes quantités de cellules de Kupffer pour les tests de toxicité des nanoparticules.

Dans le protocole suivant, les cellules de Kupffer ont été incubées avec des nanotubes de carbone fonctionnalisés (f </em> -CNTs). Les propriétés physico-chimiques uniques de NTC – c.-à-haute rapport de longueur à diamètre et grande surface, ont fait NTC candidats intéressants comme vecteurs pour des fins de thérapie et de diagnostic. Toutefois, des préoccupations ont été soulevées concernant la toxicité des nanotubes de carbone ^19, et le développement de nouveaux tests in vitro vise à accroître la compréhension des effets biologiques CNT. Toxicité chez les cellules de Kupffer est associé à un manque d'intégrité structurelle de la membrane cellulaire. Elle est mesurée par la perte de l'enzyme LDH cytoplasmique de la cellule dans le surnageant. Le principe de cette méthode est donc de supprimer tout LDH libérée et de mesurer ce qui reste dans les cellules ^20. Ceci est réalisé de préférence à la mesure de la LDH libérée dans le surnageant parce que la présence de nanotubes de carbone dans le surnageant interfère avec l'essai ^21.

Nous vous proposons l'utilisation de ce métho d'isolement des cellules de Kupffer efficace simple et économiqued pour isoler nombre élevé de cellules fonctionnelles Kupffer. Ceci permet le criblage de la toxicité d'une gamme de nanoparticules, dans un modèle de macrophage primaire pertinente.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été exécutés en conformité avec toutes les directives, les règlements et les organismes de réglementation. Le protocole en démonstration a été réalisée sous la direction et l'approbation de la réglementation de bureau au Royaume-Uni Accueil 1. Perfusion et Cell Collection (Figure 1) Figure 1:. Foie Perfusion Après l&…

Representative Results

Le nombre de cellules parenchymateuses non purifiées était conforme et a varié entre 8 et 14 x 10 6 cellules par souris (17 isolements ont été réalisées). Chaque isolement de la souris était suffisante à la plaque 16 à 28 puits. La viabilité des cellules par coloration au bleu trypan a montré la viabilité des cellules ~ 95%. Les cellules de Kupffer ont montré une forme ronde dans les 30 minutes d'incubation à 37 ° C, liée à leur morphologie adhérente incomplètes (figure 4A).</s…

Discussion

Les étapes suivantes sont essentielles pour atteindre un rendement élevé et une haute viabilité des cellules de Kupffer. Des conditions d'asepsie doivent être utilisés pour limiter le risque de contamination bactérienne et fongique. Tous les instruments doivent être stérilisés avant utilisation. Les réactifs doivent être fraîchement préparées avant d'effectuer la procédure d'isolement.

Le choix de la collagénase IV, avec une faible activité tryptique, est crucia…

Materials

Euthatal (pentobarbital sodium)	Merial
CD1 mice	Charles River	–	Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight.
HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate)	Life Technologies	14175-053	HBSS must be  Ca2+ free.
Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt	Sigma-Aldrich	E8145	EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively.
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-056	100 ml
Collagenase type IV	Worthington	CSL-4	It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation
Low glucose DMEM	Sigma-Aldrich	D5523	500 ml
RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax®)	Life Technologies	12633-012	500 ml
Penicillin/Steptomycin	Life Technologies	15140-122	100 ml
Fetal Bovine Serum	First-Link	60-00-850	500 ml
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	100 ml
Coated silica particle solution (Percoll®)	GE Healtcare	17-0891-02	Percoll® is very stable and can be kept for several years
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023	500 ml
10x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	70011-036	500 ml
Dimethyl sulfoxide	Fisher	D/4120/PB08	500 ml
LDH kit (CytoTox 96®)	Promega	G1781	Keep protected from light
DMEM phenol red free	Life Technologies	31053-028	500 ml
F4/80 antibody (Alexa 488)	AbD Serotec	MCA497A488	Do not dilute, used neat for flow cytometry
Fluorescent beads	Sigma	L2778	Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml
Name of the Material	Company	Catalog number	Comments/Description
Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing)	BD	367288
Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim)	Minisart	16534-K
Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap)	BD Biosciences, Falcon	35 2070
Petri dish (90 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	BSN 101VR20
100 μm cell strainer	BD	352360
Peristaltic pump	Watson Marlow	SciQ 300	Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol.
24-well plates	Corning	3526
96-well plates	Corning	3595
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Plate reader	BMG Labtech	FLUOstar Omega
Serrefine forceps	Hammacher GmbH	Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051	The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
Flow cytometry tubes	BD Biosciences, Falcon	352052
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)	Elkay	000-MICR-150
Cell scraper	BD Biosciences, Falcon	353086	Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates.
Name of the Reagent	Company	Catalog number	Comments/Description
EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution			HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse.
Collagenase Solution			DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum.
Kupffer Cell Isolation Medium			RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.
Kupffer Cell Culture Medium			RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.
SIP (solution of isotonic coated silica particles)			Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline  with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP.
25% SIP solution			Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline
50% SIP solution			Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline
Lysis Buffer			DMEM media with 0.9% Triton X-100
PBS/BSA Solution			Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin.