Kupffer aislamiento de células de nanopartículas de Pruebas de Toxicidad

Summary

Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.

Abstract

La gran mayoría de los estudios in vitro nanotoxicological han utilizado líneas celulares inmortalizadas por su practicidad. Sin embargo, los resultados de las pruebas de toxicidad de nanopartículas en líneas celulares inmortalizadas o células primarias han mostrado discrepancias, destacando la necesidad de extender el uso de células primarias de ensayos in vitro. Este protocolo describe el aislamiento de los macrófagos del hígado del ratón, las células de Kupffer con nombre, y su uso para estudiar la toxicidad de nanopartículas. Las células de Kupffer son la población de macrófagos más abundante en el cuerpo y constituyen parte del sistema retículo-endotelial (RES), responsable de la captura de las nanopartículas de circulación. El método de aislamiento de células Kupffer informó aquí se basa en un método de perfusión de 2 pasos, seguido de purificación en gradiente de densidad. El método, basado en la digestión de colagenasa y centrifugación de densidad, es una adaptación del protocolo original desarrollada por Smedsrød et al. diseñado para la rata isolatio células hepáticasn y proporciona un alto rendimiento (hasta 14 x 10 ⁶ células por ratón) y alta pureza (> 95%) de las células de Kupffer. Este método de aislamiento no requiere equipo sofisticado o caro y por lo tanto representa un compromiso ideal entre la complejidad y el rendimiento celular. El uso de ratones más pesados ​​(35-45 g) mejora el rendimiento del método de aislamiento sino que también facilita notablemente el procedimiento de canulación de la vena porta. La toxicidad de los nanotubos de carbono funcionalizados f -CNTs se midió en este modelo por el ensayo de LDH modificado. Este método evalúa la viabilidad celular mediante la medición de la falta de integridad estructural de la membrana de las células de Kupffer después de la incubación con -CNTs f. Inducida por -CNTs f toxicidad puede medirse constantemente utilizando este ensayo, destacando que las células de Kupffer aisladas son útiles para las pruebas de toxicidad de las nanopartículas. La comprensión global de nanotoxicología podría beneficiarse de este tipo de modelos, por lo que la selección de nanopartículas para la traducción clínica más eficiente.

Introduction

El campo de la investigación nanotoxicología pretende caracterizar el efecto biológico de las nanopartículas. Los estudios toxicológicos sobre la base de las investigaciones in vivo siguen siendo los métodos más precisos. Sin embargo, su uso está limitado por sus requisitos de coste, tiempo y trabajo ^1. Como los ensayos de alternativas, in vitro se han utilizado debido a su simplicidad y la posibilidad de desarrollar de alto rendimiento en plataformas de pruebas in vitro ² – así se amplía el número de condiciones ensayadas. La mayoría de los estudios nanotoxicological se realizan usando ensayos in vitro con líneas celulares inmortalizadas. Sin embargo, hay preocupaciones con respecto a la extrapolación de estos resultados experimentales in vivo a los efectos toxicológicos ^3. De hecho, las propiedades de las líneas celulares inmortalizadas pueden ser significativamente diferentes de los tejidos que se derivan de, por ejemplo, la transformación genética ^4, el deterioro de las características morfológicas principales5, la pérdida de la polaridad celular ⁶ y alteraciones funcionales tales como la regulación de los mediadores de la inflamación ^7.

Las células de Kupffer son la población de macrófagos más abundante en el cuerpo y están directamente en contacto con la sangre por el forro de la pared de los sinusoides hepáticos. Como parte del sistema retículo-endotelial (RES), estos macrófagos son responsables de la captura de las nanopartículas de circulación y por lo tanto, constituyen un modelo muy adecuado para estudiar la toxicidad de nanopartículas. In vivo ⁸ e in vitro ⁹ estudios de respuestas inflamatorias asociadas con las células de Kupffer expuestos a nanopartículas se han publicado en otros lugares. Las células de Kupffer también se han involucrado en la patogénesis de las enfermedades hepáticas como la enfermedad alcohólica del hígado ^10, fibrosis hepática o hepatitis viral ^{11 12.} Se informó de que las células de Kupffer aisladas proporcionan información útil para describir los mecanismos celulares involved en la interrupción del hígado ^13,14.

Varios métodos han sido reportados para aislar y purificar las células de Kupffer. Aislamiento de la célula puede resultar de la mecánica o enzimática de disociación ^15. Digestión con colagenasa muestra la ventaja de conservar la integridad funcional de las células de Kupffer, mientras que lleva a rendimiento celular de alta Kupffer ^16. Muchos enfoques experimentales, que varían en complejidad y los costes, se han utilizado para separar las células de Kupffer de otras poblaciones de células de hígado. Por ejemplo, la pureza de células Kupffer se puede lograr por inmunoafinidad ^17, electroforesis de flujo ^{18, 16} adhesión selectiva o mediante técnicas centrífugas ^16, que seleccionan las células en función de su tamaño y densidad. Una combinación de estos métodos puede ser elegido para aumentar la pureza de la población ^16. No hay consenso sobre el método ideal para el aislamiento de células de Kupffer, ya que depende principalmente de la aplicación y equipamiento disponiblest. Sin embargo, en el caso de los ensayos de toxicidad de nanopartículas, la simplicidad y de alto rendimiento de la técnica asociada con la conservación funcional de las células de Kupffer parecían ser más adecuado para esta aplicación.

El método de aislamiento de células Kupffer informó aquí se basa en un método de perfusión de 2 pasos, seguido de purificación en gradiente de densidad. El método se modificó a partir del protocolo original desarrollado por Smedsrød et al. ¹⁶ diseñado para el aislamiento de células de hígado de rata. La mayoría de los estudios informaron y describen el aislamiento de las células de Kupffer de hígado de rata. En este documento, se describe un método para aislar células de Kupffer de hígado de ratón, con un alto rendimiento y pureza. El uso de ratones reduce el coste experimento y permite el procesamiento de varios hígados para obtener grandes cantidades de células de Kupffer para las pruebas de toxicidad de las nanopartículas.

En el siguiente protocolo, las células de Kupffer se incubaron con nanotubos de carbono funcionalizados (f </em> -CNTs). Las propiedades físico-químicas únicas de CNTs – es decir, de alta relación de longitud a diámetro y gran área de superficie, han hecho CNTs candidatos interesantes como vectores para fines de terapia y el diagnóstico. Sin embargo, han surgido preocupaciones con respecto a la toxicidad de los nanotubos de carbono ^19, y el desarrollo de nuevos ensayos in vitro tiene por objeto aumentar la comprensión del efecto biológico CNT. Toxicidad en células de Kupffer se asocia con una falta de integridad estructural de la membrana celular. Esto se mide por la pérdida de la enzima LDH citoplásmica de la célula en el sobrenadante. El principio de este método, por lo tanto, es eliminar cualquier LDH liberada y medir lo que queda en las células ^20. Esto se realiza con preferencia a la medición de la LDH liberada en el sobrenadante debido a la presencia de nanotubos de carbono en el sobrenadante interfiere con el ensayo ^21.

Proponemos el uso de este simple y rentable metho aislamiento de células Kupfferd aislar alto número de células de Kupffer funcionales. Esto permite el cribado de toxicidad de una gama de nanopartículas, en un modelo de macrófagos primaria pertinente.

Protocol

Todos los experimentos con animales fueron ejecutados en cumplimiento de todas las directrices pertinentes, los reglamentos y las agencias reguladoras. El protocolo que se demostró fue realizado bajo la dirección y aprobación del reglamento oficina del Reino Unido Inicio 1. Perfusión y Cell Collection (Figura 1) Figura 1:. Liver perfusión Después de la anestesia del rató…

Representative Results

El número de células parenquimatosas no purificadas era consistente y varió entre 8 y 14 x 10 6 células por ratón (se realizaron 17 aislamientos). Cada aislamiento ratón era suficiente a la placa 16 a 28 pozos. La viabilidad celular mediante tinción con azul de tripano demostró la viabilidad celular ~ 95%. Las células de Kupffer mostraron una forma redonda dentro de 30 min de incubación a 37 ° C, en relación con su morfología adherente incompletos (Figura 4A). A las 4 horas de in…

Discussion

Los siguientes pasos son fundamentales para lograr un alto rendimiento y una alta viabilidad de las células de Kupffer. Las condiciones asépticas deben utilizarse para limitar el riesgo de contaminación bacteriana y fúngica. Todos los instrumentos deben ser esterilizados antes de su uso. Los reactivos deben prepararse justo antes de llevar a cabo el procedimiento de aislamiento.

La elección de la colagenasa IV, con baja actividad tríptico, es crucial. Los diferentes lotes del mismo pro…

Materials

Euthatal (pentobarbital sodium)	Merial
CD1 mice	Charles River	–	Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight.
HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate)	Life Technologies	14175-053	HBSS must be  Ca2+ free.
Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt	Sigma-Aldrich	E8145	EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively.
HEPES (1M)	Life Technologies	15630-056	100 ml
Collagenase type IV	Worthington	CSL-4	It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation
Low glucose DMEM	Sigma-Aldrich	D5523	500 ml
RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax®)	Life Technologies	12633-012	500 ml
Penicillin/Steptomycin	Life Technologies	15140-122	100 ml
Fetal Bovine Serum	First-Link	60-00-850	500 ml
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	100 ml
Coated silica particle solution (Percoll®)	GE Healtcare	17-0891-02	Percoll® is very stable and can be kept for several years
1x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-023	500 ml
10x Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	70011-036	500 ml
Dimethyl sulfoxide	Fisher	D/4120/PB08	500 ml
LDH kit (CytoTox 96®)	Promega	G1781	Keep protected from light
DMEM phenol red free	Life Technologies	31053-028	500 ml
F4/80 antibody (Alexa 488)	AbD Serotec	MCA497A488	Do not dilute, used neat for flow cytometry
Fluorescent beads	Sigma	L2778	Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml
Name of the Material	Company	Catalog number	Comments/Description
Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing)	BD	367288
Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim)	Minisart	16534-K
Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap)	BD Biosciences, Falcon	35 2070
Petri dish (90 x 15 mm)	Thermo Fisher Scientific	BSN 101VR20
100 μm cell strainer	BD	352360
Peristaltic pump	Watson Marlow	SciQ 300	Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol.
24-well plates	Corning	3526
96-well plates	Corning	3595
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Plate reader	BMG Labtech	FLUOstar Omega
Serrefine forceps	Hammacher GmbH	Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051	The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
Flow cytometry tubes	BD Biosciences, Falcon	352052
Microcentrifuge tubes (1.5 ml)	Elkay	000-MICR-150
Cell scraper	BD Biosciences, Falcon	353086	Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates.
Name of the Reagent	Company	Catalog number	Comments/Description
EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution			HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse.
Collagenase Solution			DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum.
Kupffer Cell Isolation Medium			RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.
Kupffer Cell Culture Medium			RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers.
SIP (solution of isotonic coated silica particles)			Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline  with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP.
25% SIP solution			Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline
50% SIP solution			Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline
Lysis Buffer			DMEM media with 0.9% Triton X-100
PBS/BSA Solution			Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin.