Kupffer Cell Isolatie Nanoparticle toxiciteit testen
Summary
Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.
Abstract
De grote meerderheid van in vitro studies hebben nanotoxicological geïmmortaliseerde cellijnen gebruikt voor hun bruikbaarheid. Echter, de resultaten van nanodeeltjes toxiciteit in geïmmortaliseerde cellijnen of primaire cellen toonden verschillen, benadrukt de noodzaak om het gebruik van primaire cellen verlengen in vitro assays. Dit protocol beschrijft de isolatie van muizenlever macrofagen, genaamd Kupffer cellen en hun toepassing toxiciteit nanodeeltjes bestuderen. Kupffer cellen zijn de meest voorkomende macrofaag bevolking in het lichaam en vormt een deel van het reticulo-endotheliale systeem (RES), die verantwoordelijk is voor de vangst van circulerende nanodeeltjes. De Kupffer cellen isolatiemethode hier gerapporteerd is gebaseerd op een 2-staps werkwijze perfusie gevolgd door zuivering op dichtheidsgradiënt. De werkwijze, gebaseerd op collagenase digestie en dichtheid centrifugatie wordt aangepast van het originele protocol ontwikkeld door Smedsrød et al. ontworpen voor rat levercellen isolation en levert hoge opbrengst (tot 14 x 10 6 cellen per muis) en een hoge zuiverheid (> 95%) van Kupffer cellen. Deze isolatie methode vereist geen geavanceerde of dure apparatuur en vormt daarom een ideale compromis tussen complexiteit en cel opbrengst. Het gebruik van zwaardere muizen (35-45 g) verbetert de opbrengst van de isolatiemethode en maakt daarnaast opmerkelijk de procedure van poortader canule. De toxiciteit van gefunctionaliseerde koolstofnanobuisjes f -CNTs gemeten in dit model de gemodificeerde LDH assay. Deze methode beoordeelt cellevensvatbaarheid door meting van het gebrek aan structurele integriteit van Kupffer celmembraan na incubatie met F -CNTs. Toxiciteit veroorzaakt door f -CNTs kunnen consequent worden gemeten met behulp van deze test, benadrukken dat geïsoleerde Kupffer cellen zijn nuttig voor de toxiciteit van nanodeeltjes testen. Het algemene begrip van nanotoxicologie kunnen profiteren van dergelijke modellen, waardoor de nanodeeltjes selectie voor klinische vertaling efficiënt.
Introduction
Het gebied van nanotoxicologie onderzoek richt zich op het biologisch effect van nanodeeltjes te karakteriseren. Toxicologische studies op basis van in vivo onderzoek blijven de meest accurate methoden. Echter, is het gebruik beperkt door de kosten, arbeid en tijd eisen 1. Als alternatief zijn in vitro assays werden gebruikt vanwege hun eenvoud en de mogelijkheid van het ontwikkelen high-throughput in vitro testplatformen 2 – zodat uitbreiding van het aantal geteste omstandigheden. De meeste nanotoxicological studies worden uitgevoerd met behulp van in vitro testen met onsterfelijk gemaakte cellijnen. Er zijn echter zorgen over de extrapolatie van deze experimentele bevindingen in vivo toxicologische effecten 3. Inderdaad kan de eigenschappen van geïmmortaliseerde cellijnen significant van weefsels ze zijn ontleend, bijvoorbeeld genetische transformatie 4, verslechtering van de belangrijkste morfologische kenmerken te5, het verlies van cellulaire polariteit 6 en functionele veranderingen, zoals de regulering van ontstekingsmediatoren 7.
Kupffer cellen zijn de meest voorkomende macrofaag populatie in het lichaam en die direct in contact met bloed door langs de wand van de lever sinusoïden. Als onderdeel van het reticulo-endotheliale systeem (RES), die macrofagen verantwoordelijk voor het opvangen van circulerende nanodeeltjes en vormen derhalve een zeer geschikt model de toxiciteit van nanodeeltjes te bestuderen. In vivo 8 en in vitro studies 9 van inflammatoire responsen geassocieerd met Kupffer cellen blootgesteld aan nanodeeltjes elders gepubliceerd. Kupffer cellen zijn ook betrokken bij de pathogenese van leverziekten zoals alcoholische leverziekte 10, leverfibrose 11 of virale hepatitis 12. Er werd gemeld dat geïsoleerde Kupffer cellen nuttig inzicht om cellulaire mechanismen inv beschrijvenolved in de lever verstoring 13,14.
Verscheidene werkwijzen zijn beschreven voor het isoleren en zuiveren Kupffer cellen. Celisolatie kan ontstaan door mechanische of enzymatische dissociatie 15. Collagenase spijsvertering toont het voordeel van het behoud van de functionele integriteit van Kupffer cellen, terwijl leidt tot hoge Kupffer celopbrengst 16. Vele experimentele benaderingen, variërend in complexiteit en kosten, zijn gebruikt om Kupffercellen scheiden van andere levercel populaties. Zo kunnen Kupffer cellen zuiverheid worden bereikt door immunoaffiniteit 17, stroom 18 elektroforese, selectieve adhesie 16 of centrifugale technieken 16 die cellen te selecteren op basis van hun grootte en dichtheid. Een combinatie van deze methoden kunnen worden gekozen om de zuiverheid van de bevolking 16 verhogen. Er is geen consensus over de ideale methode voor Kupffer cel isolatie, want het is meestal afhankelijk van de toepassing en de beschikbare uitrustingt. In het geval van toxiciteit nanodeeltjes testen, de eenvoud en hoge opbrengst van de techniek in verband met functionele behoud van Kupffer cellen bleken het meest geschikt voor deze toepassing zijn.
De Kupffer cellen isolatiemethode hier gerapporteerd is gebaseerd op een 2-staps werkwijze perfusie gevolgd door zuivering op dichtheidsgradiënt. De methode werd aangepast van het originele protocol ontwikkeld door Smedsrød et al. 16 ontworpen voor rattenlever celisolatie. De meeste studies gerapporteerd en beschreven de isolatie van Kupffer cellen uit levers rat. Hierin beschrijven we een werkwijze voor Kupffercellen isoleren uit muizenlever, met een hoge opbrengst en zuiverheid. Het gebruik van muizen reduceert het experiment kosten en maakt de behandeling van verscheidene lever grote hoeveelheden Kupffercellen toxiciteit nanodeeltjes testen te verkrijgen.
In het volgende protocol werden Kupffer cellen geïncubeerd met gefunctionaliseerde koolstof nanobuisjes (f </em> -CNTs). De unieke fysisch-chemische eigenschappen van CNTs – zoals bij hoge lengte tot diameter groot oppervlak hebben CNTs interessante kandidaten die als vectoren voor therapie en diagnose doeleinden. Echter, zijn bezorgdheid geuit over de toxiciteit van CNT 19, en de ontwikkeling van nieuwe in vitro testen is gericht op het vergroten van het inzicht in de CNT biologisch effect. Toxiciteit in Kupffer-cel is geassocieerd met een gebrek aan structurele integriteit van de celmembraan. Dit wordt gemeten door het verlies van de cytoplasmatische enzym LDH uit de cel in de supernatant. Het principe van deze methode is daarom om vrijgekomen LDH te verwijderen en meten wat overblijft in de cellen 20. Dit gebeurt in plaats van het meten van de vrijgekomen LDH in de supernatant omdat de aanwezigheid van CNTs in het supernatant interfereert met de test 21.
Wij stellen voor het gebruik van deze eenvoudige en kosteneffectieve Kupffer celisolatie method hoge aantal functionele Kupffer cellen te isoleren. Hierdoor kan de screening van toxiciteit van verschillende nanodeeltjes, in een relevante primaire macrofaag model.
Protocol
Representative Results
Discussion
De volgende stappen zijn cruciaal voor hoge opbrengst en hoge levensvatbaarheid van Kupffercellen bereiken. Aseptische omstandigheden moeten worden gebruikt om de kans op bacteriële en fungale contaminatie. Alle instrumenten moeten worden gesteriliseerd voor gebruik. Reagentia moeten vers worden bereid voor het uitvoeren van de isolatie procedure.
De keuze van de collagenase IV, met een lage tryptisch activiteit, is cruciaal. Verschillende partijen van dezelfde leverancier verschillende enz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.
Materials
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | – | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax®) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll®) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96®) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. | ||
References
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
- Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
- Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
- Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
- Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
- Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
- Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
- Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
- Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
- Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
- Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
- Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
- Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
- Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
- Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
- Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
- Wang, J. T. -. W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
- Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
- Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).
