בידוד תא Kupffer לNanoparticle בדיקת רעילות
Summary
Liver macrophages, named Kupffer cells, are responsible for the capture of circulating nanoparticles. We describe here a method, of high cell purity and yield, for Kupffer cell isolation. The modified LDH assay is used here to measure the toxicity induced by carbon nanotubes in Kupffer cells.
Abstract
רוב הגדול של מחקרי nanotoxicological במבחנה השתמשו שורות תאים הונצחו למעשיות שלהם. עם זאת, תוצאות מבדיקת רעילות ננו-חלקיקים בשורות תאים הונצחו או תאים ראשוניים הראו פערים, המדגישות את הצורך להרחיב את השימוש בתאים ראשוניים למבחנים במבחנה. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של מקרופאגים כבד עכבר, תאי Kupffer בשם, ושימוש בם כדי ללמוד רעילות ננו-חלקיקים. תאי Kupffer הם אוכלוסיית מקרופאג הנפוצה ביותר בגוף ומהווים חלק ממערכת reticulo-אנדותל (RES), אחראית ללכידתו של מחזור חלקיקים. שיטת בידוד תא Kupffer דיווחה כאן מבוססת על שיטת זלוף 2-צעד אחריו טיהור על שיפוע צפיפות. השיטה, המבוססת על מערכת עיכול collagenase וצנטריפוגה צפיפות, מותאמת הפרוטוקול המקורי שפותח על ידי אל Smedsrød et. מיועד לisolatio תא כבד החולדהn ומספק תשואה גבוהה (עד 14 x 10 6 תאים לכל עכבר) וטוהר גבוה (> 95%) של תאי Kupffer. שיטת בידוד זה אינה דורשת ציוד מתוחכם או יקר ולכן מייצגת פשרה אידיאלית בין מורכבות ותשואת תא. השימוש בעכברים כבדים יותר (35-45 גר ') משפר את התשואה של שיטת הבידוד אלא גם מקל להפליא ההליך של cannulation וריד שער. הרעילות של צינורות פחמן פונקציונליות ו -CNTs נמדדה במודל זה על ידי assay LDH שונה. שיטה זו מעריכה כדאיות תא על ידי מדידת חוסר השלמות המבנית של קרום תא Kupffer לאחר דגירה עם -CNTs F. רעילות הנגרמת על ידי -CNTs F ניתן למדוד באופן עקבי באמצעות assay זה, מדגיש כי תאי Kupffer מבודדים שימושיים לבדיקת רעילות ננו-חלקיקים. ההבנה הכוללת של nanotoxicology יכולה להפיק תועלת ממודלים כאלה, מה שהופכת את בחירת ננו-חלקיקים ליותר אפי תרגום קלינימספיק.
Introduction
תחום מחקר nanotoxicology מטרה לאפיין את ההשפעה הביולוגית של חלקיקים. מחקרים רעילים המבוססים על חקירות בvivo להישאר השיטות מדויקות ביותר. עם זאת, השימוש בם מוגבל על ידי דרישות עלות, העבודה וזמנם 1. כחלופות, במבחנה מבחני היו בשימוש בגלל פשטותם ואת האפשרות של פיתוח תפוקה גבוהה בפלטפורמות בדיקת מבחנה 2 – כך מאריכים את מספר התנאים שנבדקו. רוב מחקרי nanotoxicological מבוצעים באמצעות במבחני מבחנה עם שורות תאים הונצחו. עם זאת, קיימים חששות לגבי הניפוח של ממצאי ניסויים אלה להשפעות רעילות in vivo 3. ואכן, את המאפיינים של שורות תאים הנציחו יכולים להיות שונים באופן משמעותי מרקמות שנלקחו מ, למשל שינוי גנטי 4, הידרדרות של תכונות מורפולוגיות מפתח5, אובדן הקוטביות סלולרית 6 ושינויים פונקציונליים כגון הרגולציה של מתווכים דלקתיים 7.
תאי Kupffer הם אוכלוסיית מקרופאג הנפוצה ביותר בגוף והם ישירות במגע עם דם על ידי המצפה את הקיר של sinusoids כבד. כחלק ממערכת reticulo-אנדותל (RES), מקרופאגים אלה הם אחראים ללכידתו של מחזור חלקיקים ולכן, מהווה מודל מתאים ביותר ללמוד רעילות ננו-חלקיקים. בvivo 8 ובמבחנה 9 מחקרים של תגובות דלקתיות הקשורים בתאי Kupffer נחשפו לחלקיקים כבר פורסם במקומות אחרים. תאי Kupffer גם היו מעורבים בפתוגנזה של מחלות כבד כגון מחלת כבד אלכוהול 10, סיסטיק הכבד 11 או צהבת נגיפית 12. נמסר כי תאי Kupffer מבודדים לספק תובנה שימושי לתאר inv מנגנונים התאיolved בהפרעת כבד 13,14.
כמה שיטות כבר דיווחו לבודד ולטהר תאי Kupffer. בידוד תא יכול לנבוע מניתוק מכאני או אנזימטי 15. עיכול collagenase מראה את היתרון של שמירה על השלמות התפקודית של תאי Kupffer, בעוד שהוביל לתשואת תא הגבוה Kupffer 16. גישות ניסיוניות רבות, שונות במורכבות ועלויות, כבר משמשת להפרדה בין תאי Kupffer מאוכלוסיות תאי כבד אחרים. לדוגמא, טוהר תא Kupffer יכול להיות מושגת על ידי immunoaffinity 17, זרימת אלקטרופורזה 18, הדבקה סלקטיבית 16 או על ידי טכניקות צנטריפוגלי 16, שבחרו תאים בהתאם לגודל וצפיפותם. ניתן לבחור שילוב של שיטות אלה כדי להגדיל את טוהר של האוכלוסייה 16. אין הסכמה על השיטה האידיאלית לבידוד תא Kupffer, כפי שבעיקר תלויה בציוד היישום וזמיןלא. עם זאת, במקרה של בדיקת רעילות ננו-חלקיקים, הפשטות והתשואה גבוהה של הטכניקה הקשורים לשימור התפקודי של תאי Kupffer נראים מתאים ביותר עבור יישום זה.
שיטת בידוד תא Kupffer דיווחה כאן מבוססת על שיטת זלוף 2-צעד אחריו טיהור על שיפוע צפיפות. השיטה הייתה שונה מהפרוטוקול המקורי שפותח על ידי אל Smedsrød et. 16 מיועדים לבידוד תא כבד חולדה. רוב המחקרים שדווחו ותיארו את הבידוד של תאי Kupffer מכבדי חולדה. בזאת, אנו מתארים שיטה לבודד תאי Kupffer מהכבד עכבר, בתשואה גבוהה וטוהר. השימוש בעכברים מפחיתים את עלות הניסוי ומאפשר העיבוד של כמה כבדים להשיג כמויות גדולות של תאי Kupffer לבדיקת רעילות ננו-חלקיקים.
בפרוטוקול הבא, תאי Kupffer הודגרו עם צינורות פחמן פונקציונליות (ו </em> -CNTs). התכונות פיסיקלי הכימיות הייחודיות של צינוריות – כלומר גבוה אורך יחס קוטר ושטח פנים גדול, עשו מועמדים מעניינים צינוריות כוקטורים למטרות טיפול ואבחון. עם זאת, חששות הועלו בנוגע לרעילות של צינוריות 19, ופיתוח מוצרים החדשים בבדיקות מבחנה שמטרתו להגביר את ההבנה של השפעה ביולוגית CNT. רעילות בתא Kupffer קשורה עם חוסר השלמות מבנית של קרום התא. זו נמדדת על ידי האובדן של LDH אנזים cytoplasmic מהתא לsupernatant. העיקרון של שיטה זו, ולכן, הוא להסיר את כל LDH שוחרר ולמדוד את מה שנותר בתאים 20. הדבר נעשה בהעדפה למדידת LDH שוחרר בsupernatant בגלל הנוכחות של צינוריות בsupernatant מפריעה assay 21.
אנו מציעים את השימוש בmetho בידוד תא Kupffer זה פשוט וחסכוניד לבודד את המספר גבוה של תאי Kupffer פונקציונליים. זה מאפשר ההקרנה של רעילות של מגוון רחב של חלקיקים, במודל מקרופאג עיקרי רלוונטי.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הבאים הם קריטיים להשגת תשואה גבוהה וכדאיות גבוהה של תאי Kupffer. יש להשתמש בתנאי אספטי להגביל את הסיכון של זיהום חיידקים ופטריות. כל המכשירים צריכים להיות מעוקרים לפני השימוש. ריאגנטים צריכים להיות מוכנים טריים לפני ביצוע הליך הבידוד.
<p class="jove_content" style=";text-align:righ…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by EU FP7-ITN Marie-Curie Network program RADDEL. MB and KAJ would like to acknowledge Joe Varguese and Rui Serra Maia for their help and suggestions along the optimization of the Kupffer cell isolation.
Materials
| Euthatal (pentobarbital sodium) | Merial | ||
| CD1 mice | Charles River | – | Mouse weight should vary from 35 to 45 g. We advise the use of male CD1 mice as their weight increase rapidly (e.g. a male CD1 mouse of 7 weeks old exceeds 35 g in weight). It is also advised to contact the animal supplier in advance to arrange for the delivery of older animals. Alternatively animals can be in-house to reach the desired weight. |
| HBSS (Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate) | Life Technologies | 14175-053 | HBSS must be Ca2+ free. |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) tetrasodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | EDTA can also be used but EGTA has the advantage of chelating Ca2+ selectively. |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | 100 ml |
| Collagenase type IV | Worthington | CSL-4 | It is advised to test different batches of collagenase or at least mention to the supplier the product has to be suitable for liver cell isolation |
| Low glucose DMEM | Sigma-Aldrich | D5523 | 500 ml |
| RPMI (with sodium pyruvate and Glutamax®) | Life Technologies | 12633-012 | 500 ml |
| Penicillin/Steptomycin | Life Technologies | 15140-122 | 100 ml |
| Fetal Bovine Serum | First-Link | 60-00-850 | 500 ml |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 100 ml |
| Coated silica particle solution (Percoll®) | GE Healtcare | 17-0891-02 | Percoll® is very stable and can be kept for several years |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 10010-023 | 500 ml |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 70011-036 | 500 ml |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | D/4120/PB08 | 500 ml |
| LDH kit (CytoTox 96®) | Promega | G1781 | Keep protected from light |
| DMEM phenol red free | Life Technologies | 31053-028 | 500 ml |
| F4/80 antibody (Alexa 488) | AbD Serotec | MCA497A488 | Do not dilute, used neat for flow cytometry |
| Fluorescent beads | Sigma | L2778 | Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red. 1 ml |
| Name of the Material | Company | Catalog number | Comments/Description |
| Butterfly blood collection set (23G/305mm long tubing) | BD | 367288 | |
| Syringe Filters (0.22 μm Blue Rim) | Minisart | 16534-K | |
| Centrifuge Tubes (50 ml Blue Cap) | BD Biosciences, Falcon | 35 2070 | |
| Petri dish (90 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | BSN 101VR20 | |
| 100 μm cell strainer | BD | 352360 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | SciQ 300 | Rinse tubing before and after each usage with sterile PBS and 70% ethanol. |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| 96-well plates | Corning | 3595 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Plate reader | BMG Labtech | FLUOstar Omega | |
| Serrefine forceps | Hammacher GmbH | Art. Nr. HSE 004-35 / Cat. Nr. 221-0051 | The serrefine forceps allow to clamp the vessel cannulated with the 23G needle without the need of holding the forceps during the perfusion procedure. URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) |
| Flow cytometry tubes | BD Biosciences, Falcon | 352052 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Elkay | 000-MICR-150 | |
| Cell scraper | BD Biosciences, Falcon | 353086 | Cut blade extremities with a pair of scissors to scrape cells in 24-well plates. |
| Name of the Reagent | Company | Catalog number | Comments/Description |
| EGTA (Ethylene Glycol Tetraacetic Acid)/HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) Solution | HBSS containing 0.5 mM EGTA and 25 mM HEPES. Adjust pH to 7.4. Prepare 50 ml for each liver to perfuse. | ||
| Collagenase Solution | DMEM low glucose containing collagenase type IV at 100 UI/ml, 15 mM HEPES and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Adjust pH to 7.4. Prepare 100 ml for each liver to perfuse. After adding the collagenase, it is advised to warm up the solution for 30 min before use. This allows the collagenase activity to be optimum. | ||
| Kupffer Cell Isolation Medium | RPMI containing, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptomycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| Kupffer Cell Culture Medium | RPMI containing 10% Fetal Bovine Serum, 1% Non-Essential Amino-Acids (v/v),1% Glutamax® (v/v) and 1% Penicllin/Streptamycin (v/v). Prepare at least 100 ml for 1-3 livers. | ||
| SIP (solution of isotonic coated silica particles) | Mix 1.7 ml of 10x Phosphate Buffered Saline with 15.3 ml of Percoll® to obtain 17mL of SIP. | ||
| 25% SIP solution | Mix 5 ml of SIP with 15 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| 50% SIP solution | Mix 10 ml of SIP with 10 ml of 1x Phosphate Buffered Saline | ||
| Lysis Buffer | DMEM media with 0.9% Triton X-100 | ||
| PBS/BSA Solution | Prepare fresh Phosphate Buffered Saline pH 7.4 with 1% Bovine Serum Albumin. | ||
References
- Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
- Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
- Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
- Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
- Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
- Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
- Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
- Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
- Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
- Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
- Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
- Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
- Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
- Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
- Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
- Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
- Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
- Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
- Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
- Wang, J. T. -. W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
- Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
- Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14 (2003).
