The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.
Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.
Fosfatidiletanolamina metiltransferasi (PEMT) enzimi catalizzano l'attacco covalente di uno o più gruppi metilici utilizzando S -adenosylmethionine (SAM) come il gruppo metilico donatore sul PE, PE o monometil-dimetil-PE dare monometil-PE, dimetil-PE e / o fosfatidilcolina (PC). Questi enzimi sono quasi onnipresenti nelle cellule animali e funghi. Possono anche essere trovati in alcune piante 1 e circa il 10% dei batteri, in particolare quelli che interagiscono con eucarioti 2.
PEMTs sono rilevanti alla biologia della cellula non solo contribuendo alla produzione di PC, che è la classe principale lipidi nelle cellule animali, ma anche compiendo altre importanti funzioni cellulari. Nei mammiferi, PEMTs sono espressi principalmente nel fegato dove sono richiesti per il normale secrezione di lipoproteine a bassissima densità e contribuiscono anche all'obesità indotta dalla dieta 3, aterosclerosi 4, e l'insulina resistonoANCE 5. Inoltre, PEMT mammiferi sono espressi anche negli adipociti, anche se a livelli più bassi, e partecipare a deposizione di grasso 6, 7. Ruolo PEMT nello sviluppo del cancro 8, 9 apoptosi, e la crescita delle cellule 10 sono stati anche dimostrato. Nei batteri, enzimi PEMT hanno dimostrato di essere importante per la normale crescita delle cellule 2, la virulenza 2, e simbiosi con la pianta ospite 11.
L'obiettivo e le motivazioni del presente protocollo è quello di misurare l'attività PEMT da estratti cellulari interi, senza la necessità di purificare l'enzima. Due protocolli distinti sono stati sviluppati per misurare l'attività PEMT. Il primo e più comune misura il trasferimento del gruppo metilico triziata da SAM radioattivo su PE, che è l'argomento di questo articolo. Questo protocollo è stato originariamente sviluppato per misurare l'attività PEMT dal lievito 12 e cellule di mammifero (fegato) 13 per ottenere un understANDing di biosintesi PC in queste cellule, nonché per determinare la specificità di questi enzimi. Successivamente, questa tecnica è stata applicata ad altri tipi di cellule, come i batteri 2 (utilizzando un valore pH basico per il test se 15) e protozoi parassiti 14. Questa tecnica può essere utilizzata con estratti cellulari interi nonché enzima purificato, e può potenzialmente essere applicato a qualsiasi sistema di estratto cellulare. Un test non radioattivo è stato progettato che si basa sulla quantificazione enzimatica di S -adenosylhomocysteine, il prodotto di transmetilazione SAM 16. Quest'ultimo test può essere più conveniente in quanto non comporta radioattività ma è adatto solo per gli enzimi purificati.
Questa semplice, rapido test PEMT consente la quantificazione di forme metilate di PE che deriva dal trasferimento di gruppi metilici radioattive da SAM su PE utilizzando estratto cellulare tutto come fonte proteica. È veloce, sensibile, riproducibile e adatto anche per enzimi purificati 17. Monomethyl- o dimetil-PE possono essere aggiunti al test se il metiltransferasi di interesse specifico per questi substrati anziché PE 12,13,18,19. Se viene utilizzato purificato enzima PEMT, PE può essere a…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by NIH grants ARRA RO3 AI078145 and 1SC3GM113743 to RZ.
S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine (specific activity of 5-15 Ci/mMole) | Perkin Elmer | NET155050UC | Aliquot the reagent and freeze at -20 °C; follow radiation safety guidelines while using this reagent |
Protease inhibitor cocktail | Roche Life Sciences | 11836170001 | dilute it fresh |
Glass beads, acid washed, 425-600 mm | Sigma Aldrich | G8772 | |
Bicinchoninic acid solution | Sigma Aldrich | B9643 | |
Copper (II) sulfate | Sigma Aldrich | C2284 | |
Scintillation counter MicroBeta2 with 1-detector | Perkin Elmer | 2450-0010 | |
Spectrophotometer Biomate 3 | Thermo Scientific | 840208300 | |
BSA stock solution (10 mg/ml) | New England Biolabs | B9001S | |
Scintillation liquid | Research Product International Corp | 111198 | |
S-(5'-Adenosyl)-L-methionine chloride (hydrochloride) | Cayman Chemicals | 13956 | dilute the reagent in 20 mM HCl and freeze aliquots at -80 °C |