Ensayo in vitro para medir Fosfatidiletanolamina metiltransferasa actividad

Summary

The present report describes an in vitro enzymatic assay to measure phosphatidylethanolamine methyltransferase activity using Leishmania cell extracts. This assay is based on the transfer of a radioactive methyl group from S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine onto endogenous phosphatidylethanolamine.

Abstract

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from S-adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine, monomethyl-phosphatidylethanolamine, or dimethyl-phosphatidylethanolamine to give either monomethyl-phosphatidylethanolamine, dimethyl-phosphatidylethanolamine or phosphatidylcholine. These enzymes are ubiquitous in animal cells, fungi, and are also found in approximately 10% of bacteria. They fulfill various important functions in cell physiology beyond their direct role in lipid metabolism such as in insulin resistance, diabetes, atherosclerosis, cell growth, or virulence. The present manuscript reports on a simple cell-free enzymatic assay that measures the transfer of tritiated methyl group(s) from S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine onto phosphatidylethanolamine using whole cell extracts as an enzyme source. The resulting methylated forms of phosphatidylethanolamine are hydrophobic and thus, can be separated from water soluble S-[Methyl-³H]adenosyl-L-methionine by organic extraction. This assay can potentially be applied to any other cell types and used to test inhibitors/drugs specific to a phosphatidylethanolamine methyltransferase of interest without the need to purify the enzyme.

Introduction

Metiltransferasa fosfatidiletanolamina (PEMA) enzimas catalizan la unión covalente de uno o más grupos metilo utilizando S -adenosylmethionine (SAM) como donante de metilo en PE grupo, monometil o dimetil-PE-PE para dar monometil-PE, dimetil-PE y / o fosfatidilcolina (PC). Estas enzimas son casi omnipresentes en las células animales y hongos. También se pueden encontrar en algunas plantas ^{1 y} aproximadamente el 10% de las bacterias, particularmente aquellos que interactúan con ² eucariotas.

PEMTs son relevantes para la biología de la célula no sólo contribuyendo a la producción de PC, que es la principal clase de lípidos en las células animales, sino también mediante el cumplimiento de otras funciones celulares importantes. En los mamíferos, PEMTs se expresan principalmente en el hígado donde son requeridas para la secreción normal de la lipoproteína de muy baja densidad y también contribuyen a la obesidad inducida por la dieta ^{3, 4} aterosclerosis, y la insulina se resistenANCE ^5. Además, PEMA mamíferos también se expresan en los adipocitos, aunque a niveles más bajos, y participar en la deposición de grasa ^{6, 7.} PEMA papel en el desarrollo del cáncer ^{8, 9} apoptosis, y ¹⁰ el crecimiento celular también se ha demostrado. En las bacterias, las enzimas PEMA han demostrado ser importantes para el crecimiento normal de las células ^2, la virulencia ^2, y la simbiosis con la planta huésped ^11.

El objetivo y razón de ser del presente protocolo es para medir la actividad PEMA a partir de extractos de células enteras, sin la necesidad de purificar la enzima. Dos protocolos distintos se han desarrollado para medir la actividad PEMA. La primera y más común se mide la transferencia de un grupo metilo tritiada de SAM radiactivo en PE, que es el tema de este artículo. Este protocolo ha sido desarrollado originalmente para medir la actividad de la levadura PEMA ¹² y células de mamíferos (hígado) ¹³ para obtener una understanding de la biosíntesis de PC en estas células, así como para determinar la especificidad de estas enzimas. Más tarde, esta técnica se ha aplicado a otros tipos de células tales como bacterias ² (utilizando un valor de pH básico para el ensayo aunque ¹⁵⁾ y parásitos protozoarios ^14. Esta técnica se puede utilizar con extractos de células enteras, así como enzima purificada, y potencialmente se puede aplicar a cualquier sistema de extracto celular. Un ensayo no radiactivo también se ha diseñado que se basa en la cuantificación enzimática de S -adenosylhomocysteine, el producto de transmetilación de SAM ^16. El último ensayo puede ser más conveniente, ya que no implica la radiactividad pero sólo es adecuado para las enzimas purificadas.

Protocol

1. Preparación de la célula Extracto Cultivar las células de Leishmania en una botella de plástico estéril sellado con tapa de aire ajustado a 26 ºC en un medio hecho de 1x M199 suplementado con 20 mM HEPES pH 7,4, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 5 mg / ml heme , 0,35 g / L NaCO 2 H, adenina 0,1 mM y 2 g / ml biopterina sin agitación. Recoger las células por centrifugación a 1500 g durante 5 min a 4 ºC cuando alcanzan una densidad celular de 1-2 x 10 <sup…

Representative Results

La Figura 1 muestra un ensayo de PEMA dependiente del tiempo, que se llevó a cabo con extracto de células enteras Leishmania como una fuente de enzima usando PE endógena como sustrato. La cantidad de radiactividad en la fase orgánica se cuantificó por recuento de centelleo. Los números resultantes se utilizan para calcular la cantidad de grupos metilo tritiados transferidos a PE. La actividad PEMA fue lineal durante aproximadamente 20 min. A continuación,…

Discussion

Este ensayo PEMA simple, rápida permite la cuantificación de las formas metiladas de PE que resulta de la transferencia de grupos metilo radiactivos de SAM en PE utilizando extracto de células enteras como fuente de proteína. Es rápido, sensible, reproducible, y también es adecuado para las enzimas purificadas ^17. Monometil- o dimetil-PE se pueden añadir a el ensayo si el metiltransferasa de interés es específica para estos sustratos en lugar de PE ^12,13,18,19. Si se utiliza la enzima puri…

Materials

S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine (specific activity of 5-15 Ci/mMole)	Perkin Elmer	NET155050UC	Aliquot the reagent and freeze at -20 °C; follow radiation safety guidelines while using this reagent
Protease inhibitor cocktail	Roche Life Sciences	11836170001	dilute it fresh
Glass beads, acid washed, 425-600 mm	Sigma Aldrich	G8772
Bicinchoninic acid solution	Sigma Aldrich	B9643
Copper (II) sulfate	Sigma Aldrich	C2284
Scintillation counter MicroBeta2 with 1-detector	Perkin Elmer	2450-0010
Spectrophotometer Biomate 3	Thermo Scientific	840208300
BSA stock solution (10 mg/ml)	New England Biolabs	B9001S
Scintillation liquid	Research Product International Corp	111198
S-(5'-Adenosyl)-L-methionine chloride (hydrochloride)	Cayman Chemicals	13956	dilute the reagent in 20 mM HCl and freeze aliquots at -80 °C