فيفو السابقين الثقافة من الفرخ مخيخي شرائح المستهدفة ومكانيا Electroporation للمن الحبيبة السلائف الخلية

Summary

الطبقة الحبيبية الخارجية للدماغ هي موقع أكبر التضخيم العابر في الدماغ النامية. هنا، نقدم بروتوكول لاستهداف التعديل الوراثي لهذه الطبقة في ذروة انتشار استخدام خارج الجسم الحي Electroporation للوثقافة شرائح للدماغ من الجنينية يوم 14 افراخ الدجاج.

Abstract

الطبقة الحبيبية الخارجية للدماغ (EGL) هي موقع أكبر التضخيم العابر في الدماغ النامية، ونموذجا ممتازا لدراسة انتشار الخلايا العصبية والتمايز. وبالإضافة إلى ذلك، كانت التعديلات التطورية للقدرة التكاثري من المسؤول عن التوسع الكبير في حجم المخيخ في amniotes، مما يجعل من المخيخ نموذجا ممتازا للدراسات ايفو-DEVO من الدماغ الفقاريات. الخلايا المكونة للEGL، الأسلاف الحبيبية للدماغ، كما تمثل خلية كبيرة من أصل لنخاعي، ورم الخلايا العصبية لدى الأطفال الأكثر انتشارا. بعد التضخيم العبور، السلائف الحبيبية تهاجر شعاعيا في الطبقة الحبيبية الداخلية من المخيخ حيث أنهم يمثلون أكبر عدد من الخلايا العصبية في أدمغة الثدييات ناضجة. في الفرخ، وذروة EGL الانتشار يحدث في نهاية الأسبوع الثاني من الحمل. من أجل استهداف التعديل الوراثي لهذه الطبقة فيذروة الانتشار، قمنا بتطوير طريقة للتلاعب الجيني من خلال خارج الجسم الحي Electroporation للشرائح المخيخ من الجنينية يوم 14 افراخ الدجاج. هذه الطريقة يلخص عدة جوانب هامة من الجسم الحي في الحبيبية تطوير الخلايا العصبية، وسوف يكون من المفيد في خلق فهم شامل للدماغ تكاثر الخلايا الحبيبية والتمايز، وبالتالي التنمية المخيخ، وتطور والمرض.

Introduction

المخيخ يجلس في نهاية الأمامي من الدماغ المؤخر وهي المسؤولة عن دمج المعالجة الحسية والحركية في الدماغ ناضجة وكذلك تنظم العمليات العقلية العليا ^1. في الثدييات والطيور، وأنها تمتلك التشكل تفصيلا ورقي بشكل كبير، وهو منتج من التضخيم عبور واسعة من الأسلاف خلال التنمية التي تنتج أكثر من نصف الخلايا العصبية في الدماغ الكبار. وكان المخيخ موضوع دراسة للبيولوجيا عصبية لعدة قرون، في عهد الجزيئي تلقت أيضا اهتماما كبيرا. ويتصل هذا ليس فقط لوظائفه الحيوية للاهتمام في حد ذاتها، ولكن أيضا إلى حقيقة أنه متورط بشكل كبير في الأمراض التي تصيب البشر بما في ذلك اضطرابات وراثية التنموية مثل اضطرابات طيف التوحد ² وأبرزها سرطان المخيخ، نخاعي ^3، الذي هو الدماغ عند الأطفال الأكثر انتشارا ورم. الأهم من ذلك، هو نظام نموذجا ممتازا ضمن ملحقالتراث الثقافي غير المادي لدراسة تخصيص مصير وتكوين الخلايا العصبية أثناء نمو المخ ^4. في السنوات الأخيرة، كما ثبت كنظام نموذج لدراسة مقارنة لنمو الدماغ، وذلك بسبب التنوع الهائل في أشكال المخيخ ينظر عبر نسالة الفقاريات ^10/05.

المخيخ يتطور من نصف ظهري من قسيم معيني 1 في الدماغ المؤخر ¹¹ وتنمويا ويتكون من اثنين من السكان السلف الأساسي، الشفة المعينية ومنطقة البطين. الشفة المعينية تمتد في جميع أنحاء المنطقة الظهرية من الظهارة العصبية من الدماغ المؤخر على الحدود مع لوحة السقف. ومن مهد الخلايا العصبية مثير glutamatergic من المخيخ ^12-14. في منطقة البطين يثير في GABAergic الخلايا العصبية للدماغ المثبطة، أبرزها الخلايا العصبية الكبيرة العصبية ^14،15. في وقت لاحق في التنمية (من نحو يوم الجنينية 13.5 في الماوس؛ E6 في فرخ ^16)، glutamatergic PROGENitors الهجرة بشكل طفيف من الشفة المعينية وتشكل طبقة حنوني من الأسلاف: تسمى منطقة السلف الثانوية الطبقة الحبيبية الخارجية (EGL). ومن هذه الطبقة التي يخضع التضخيم العبور الواسع النطاق الذي يؤدي إلى أعداد هائلة من الخلايا العصبية الحبيبية وجدت في الدماغ ناضجة.

منذ فترة طويلة ارتبط انتشار في EGL إلى الموقع الفرعي حنوني الذي ينتج عن الهجرة عرضية من المعينية شفة ^17، مع التحول إلى خروج دورة الخلية وتمايز الخلايا العصبية الأسلاف ارتباطهم خروجهم من طبقة EGL الخارجية في منتصف EGL ^18. الهجرة عرضية واسعة من الخلايا الحبيبية بعد الإنقسامية في محور وسطي الجانبي يحدث في الوسط والداخلي جي ^19، قبل الهجرة النهائية شعاعي في الطبقة الحبيبية الداخلية للقشرة المخ ناضجة. هجرة الخلايا من الشفة المعينية على سطح المخيخ تعتمد على CXCL12 إشارات من الحنون ^20-22 </sup> والخلايا الحبيبية التعبير عن مستقبلات CXCL12 CXCR4. الهجرة عرضية من هو هكذا تذكر أن من عرضية القشرة المخية الحديثة المهاجرة السكان عصبون المثبطة ^23-25. يثير الاهتمام والفضول، واقترح الإلكترون الدراسات المجهرية ¹⁷ أن الخلايا EGL مع التشكل التكاثري البقاء على اتصال حنوني، وربط سلوك الخلية مع القدرة على التكاثر بطريقة تذكرنا الأسلاف القاعدية من القشرة الثدييات ^26. وينعكس هذا في الطبقات المذكور من EGL إلى ثلاث طبقات فرعية التي تم تعريفها من قبل بيئات خارج الخلية المتميزة والتي لها السلائف الحبيبية متميزة التعبير الجيني التواقيع ^18.

انتشار الأسلاف في oEGL يحدث مع التوزيع الطبيعي للأحجام استنساخ بحيث عندما يتم بشكل فردي وصفت الأسلاف وراثيا في نهاية التطور الجنيني في الماوس، فإنها تؤدي إلى معدل متوسط ​​250-500 ز تالية للتفتلالخلايا العصبية ranule ^27،28. انتشار يعتمد على مولد للتفتل يشير SHH من الخلايا العصبية الكامنة وراء العصبية ^29-32. وقد تبين القدرة على الرد على SHH أن تعتمد كليا على الخلية التعبير المستقل للعامل النسخ Atoh1، سواء في المختبر ³³ والمجراة ^34،35. وبالمثل، فقد تبين خروج دورة الخلية والتمايز أن تعتمد على التعبير عن عامل النسخ المصب NeuroD1 ^36، والتي من المحتمل أن يكون كاظمة مباشر من Atoh1 ^37.

وعلى الرغم من هذا التقدم، والتقدم الكبير في فك رموز أساس بيولوجي خلية من دورة الخلية خروج ^38-42، الآلية الجزيئية الأساسية (ق) التي تكمن وراء قرار الخروج من دورة الخلية والانتقال من السلف إلى الخلايا العصبية التفريق، و يرتبط الهجرة عرضية تالية للتفتل في EGL الداخلي فضلا عن التبديل لاحقإلى الهجرة شعاعي، لا تزال غير مفهومة تماما. هذا هو إلى حد كبير بسبب استعصاء التجريبي للEGL: فوات النامية، ويصعب استهداف وراثيا منذ العديد من نفس الجزيئات العصبية هي أيضا في الحياة السلائف الحبيبية في وقت سابق حاسمة في الشفة المعينية. للتغلب على هذه المشكلة، وقد وضعت العديد من الكتاب في الجسم الحي وخارج الحي Electroporation للكوسيلة لاستهداف المخيخ ما بعد الولادة في القوارض ^43-48. هنا، نحن الرواد في استخدام خارج الجسم الحي Electroporation للفي فرخ لدراسة EGL، التي تمثل مزايا كبيرة من حيث التكلفة والراحة. لدينا طريقة Electroporation للوخارج الحي ثقافة شريحة من نسيج دماغ الفرخ يستخدم تشريح الأنسجة الجنينية من يوم 14 الكتاكيت في ذروة EGL الانتشار. هذا الأسلوب يسمح الاستهداف الجيني للEGL بشكل مستقل من الشفة المعينية وسوف يمهد الطريق لتشريح الجيني للانتقال من الحبيبيةالسلف لتالية للتفتل الخلايا العصبية الحبيبية في المخيخ.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ جميع التجارب مع فقا لكينجز كوليدج لندن، المملكة المتحدة والمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان UK زارة الداخلية. 1. تشريح E14 المخيخ احتضان البيض البني الدجاج المخصب "ف…

Representative Results

يوضح هذا القسم أمثلة من النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام Electroporation للشريحة وثقافة المخيخ من الجنينية يوم 14 فرخ. ويوضح تشريح المخيخ في الشكل 1 ويظهر غرفة Electroporation للاقامة في الشكل 2. نظهر أنه من الممكن electroporate…

Discussion

بروتوكول ذكرت هنا يصف طريقة لتشريح، electroporating وزراعة شرائح من الجنينية يوم 14 المخيخ من الفرخ. هذا البروتوكول يتيح استهداف Electroporation لللمناطق محورية صغيرة من EGL، بما في ذلك استهداف معزولة من فصوص المخيخ الفردية. فإنه يتيح التحليل الجيني والتصوير بدقة عالية والراحة، وبت?…

Materials

McIlwain tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Cut at 300μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamine	Sigma	G7513
penicillin/streptomycin	Sigma	P4333
0.4μm culture insert	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.