チック小脳スライスと顆粒細胞前駆体の空間的にターゲットを絞ったエレクトロポレーションの ex vivo培養

Summary

小脳外顆粒層は、脳の発達で最大のトランジット増幅のサイトです。ここでは、胚の14日目のニワトリ胚からex vivoでエレクトロポレーションおよび小脳スライスの文化を使用して、増殖のピーク時にこの層に遺伝子改変をターゲットにするプロトコルを提示します。

Abstract

小脳外顆粒層（EGL）は、脳の発達で最大のトランジット増幅のサイト、および神経増殖および分化を研究するための優れたモデルです。また、その増殖能力の進化の変更は、小脳脊椎動物の脳のEVO-DEVO研究のための優れたモデルを作り、羊膜における小脳のサイズの劇的な拡大を担当しています。 EGLを構成する細胞は、小脳顆粒前駆細胞は、また、髄芽腫のための最も一般的な小児神経腫瘍の起源の有意な細胞を表します。トランジット増幅後、顆粒の前駆体は、彼らが成熟した哺乳動物の脳における最大のニューロン集団を表す小脳の内部顆粒層に半径方向に移動します。ひよこでは、EGLの増殖のピークは妊娠の第2週の終わりに向かって発生します。この層での遺伝子改変を標的とするために増殖のピークは、我々は、胚14日目のニワトリ胚から小脳スライスのex vivoでのエレクトロポレーションを介して、遺伝子操作のための方法を開発しました。この方法は、 インビボでの顆粒ニューロンの発達のいくつかの重要な局面を再現すると、小脳顆粒細胞の増殖および分化の、ひいては小脳の開発、展開、および疾患の完全な理解を生成するのに有用であろう。

Introduction

小脳は、後脳の前方端に座って、成熟した脳内の感覚と運動処理の統合を担当するだけでなく、高い認知過程^1を規制です。哺乳類や鳥類では、成人の脳におけるニューロンの半分以上が生産する開発中に、前駆細胞の大規模なトランジット増幅の産物を精巧な形態を有し、重く葉状されます。小脳は、何世紀にもわたって、および分子時代の神経生物学者のための調査の対象となっている、同様に重要な注目を集めています。これは、本質的に興味深い生物学だけでなく、それが頻繁にそのような最も一般的な小児の脳である自閉症スペクトラム障害²と最も顕著に小脳癌、髄芽腫^3、などの発達の遺伝的障害を含む、ヒトの疾患に関与しているという事実だけでなく、関連します腫瘍。重要なことは、WH内の優れたモデル系でありますICHは、脳の発達⁴中に運命の割り当てと神経新生を研究します。近年では、それはまた、脊椎動物系統^5-10横切っ見小脳形態の巨大な多様性のために、脳の発達の比較研究のためのモデル系として確立されています。

小脳は、後脳¹¹でrhombomere 1の背側半分から発達と発達二つの主要な前駆細胞集団、菱形リップと脳室帯から構成されています。菱形リップは、屋根板との国境で後脳の神経上皮の背部の周りに延びます。これは、小脳^12-14のグルタミン酸作動性ニューロン興奮性の発祥の地です。脳室帯は最も顕著に抑制GABA作動性小脳ニューロン、大プルキンエニューロン^14,15を生じさせます。その後、開発中（マウスでは約胎生13.5から、ひよこ¹⁶でE6）、グルタミン酸作動PROGENitorsは菱形リップから接線方向に移動して、前駆細胞の軟膜層を形成：二前駆ゾーンは外部顆粒層（EGL）と呼ばれます。これは、成熟した脳で見つかった顆粒ニューロンの膨大な数につながる大規模なトランジット増幅を受け、この層です。

EGLでの増殖は、長い細胞周期出口に切り替え、中央に外側EGL層からの出口に関連している前駆細胞の神経分化と、菱形^リップ 17から接線方向の移行から得られるサブ軟膜の場所にリンクされていますEGL ^18。内側-外側軸における有糸分裂後の顆粒細胞の広範な接線方向の移行は、成熟した小脳皮質の内側顆粒層への最終的な放射状の移行前に、ミドルとインナーEGL ¹⁹で発生します。小脳表面上の菱形リップからの細胞の移動は、軟膜^20-22からCXCL12シグナリングに依存しています</sup>と顆粒細胞は、CXCL12受容体CXCR4を発現します。彼らの接線方向の移行は、このような阻害介在ニューロン集団に^{23-25 ​​の移行}新皮質の接線方向のそれを彷彿とさせます。興味深いことに、電子顕微鏡の研究^{17は、増殖}形態を持つEGL細胞が哺乳類の大脳皮質²⁶の基底前駆細胞を連想させるようにして増殖能力を有する細胞の挙動を結ぶ、軟膜の接触を維持することを示唆しています。これは、個別の細胞外環境によって定義され、顆粒の前駆体は、異なる遺伝子発現シグネチャ¹⁸を持っているされている3つの副層へのEGLの前述の層別化に反映されています。

oEGLにおける前駆細胞の増殖は、前駆細胞を個別に遺伝的にマウスでは胚発生の末端で標識されたとき、彼らは250〜500グラムの有糸分裂後の中央値の平均を生じさせるようなクローンサイズの正規分布で発生ranuleニューロン^27,28。増殖は、プルキンエニューロン^{29-32の根底にある}から分裂促進Shhシグナル伝達に依存しています。 SHHに応答する能力は 、in vitro およびin vivo ^{33 34,35} の両方において 、転写因子のAtoh1の細胞自律的な発現に完全に依存することが示されています。同様に、細胞周期の出口と分化は、おそらくのAtoh1 ³⁷の直接のリプレッサーである下流の転写因子NeuroD1 ³⁶の発現に依存することが示されています。

細胞周期出口^38〜42の細胞生物学的基礎を解読で、この進歩し、かなりの進歩にもかかわらず、意思決定の根底にある基本的な分子機構（複数可）は、細胞周期を終了し、差別化ニューロンへの前駆から移行すること、およびインナーEGLならびに後、スイッチの関連する有糸分裂後の接線方向の移行ラジアル移行に、完全には理解のまま。これは、EGLの実験的扱いにくさの大部分は次のとおりです。同じ神経性分子の多くが菱形リップで以前顆粒前駆体の生活の中でも極めて重要であるため、それが遅れて開発している、と遺伝的に標的にすることは困難。この問題を克服するために、多数の著者は、げっ歯類^43-48で出生後の小脳を対象とする方法として in vivo および ex vivoエレクトロポレーションで開発しています。ここでは、コストと利便性の面で顕著な利点を表すEGLを研究するために、ニワトリにex vivoでのエレクトロポレーションの使用を開拓します。私たちのエレクトロポレーションの方法とひよこのex vivoでのスライス培養小脳組織は、EGLの増殖のピークで組織胚の日から解剖14雛を使用しています。この方法は、独立して菱形リップのEGLの遺伝子ターゲティングを可能にし、顆粒からの移行の遺伝的解剖のための段階を設定します小脳における分裂停止後の顆粒ニューロンの前駆。

Protocol

注意：全ての実験は、キングスカレッジロンドン、英国、英国内務省動物保護ガイドラインに基づいて実施しました。 E14小脳の1解剖胚14日目に38℃で茶色の受精鶏卵をインキュベートします。 卵のはさみを使用すると、 卵内ニワトリ胚を刎ねると氷冷PBS（ 図1A）を含むペトリ皿に頭を削除します。 標準の鉗子を使用して、目と?…

Representative Results

このセクションでは、胚の14日目のニワトリからスライスエレクトロポレーションおよび小脳の文化を使用して得ることができる結果の例を示します。小脳の解剖は 、図1に示され、セットアップのエレクトロポレーションチャンバーは、図2に示されている。我々は、それが成功したin vitroで （ 図3A）、その構…

Discussion

ここで報告プロトコルは、解剖電気穿孔とひよこから胚14日目小脳のスライスを培養するための方法を説明します。このプロトコルは、個々の小脳ローブの孤立したターゲティングを含むEGLの小さな焦点領域にエレクトロポレーションのターゲティングが可能。これは、高解像度と利便性で遺伝子解析とイメージングを可能にし、低コストでげっ歯類^43-47で確立された技術と比較。こ?…

Materials

McIlwain tissue chopper	Mickle Laboratory Engineering Ltd		Cut at 300μm for best results.
Basal Medium Eagle (Gibco)	Life Technologies	41010-026
L-glutamine	Sigma	G7513
penicillin/streptomycin	Sigma	P4333
0.4μm culture insert	Millipore	PICM0RG50
TSS20 Ovodyne electroporator	Intracel	01-916-02	Use 3x10v, 10ms pulses for electroporation.