ヒト下垂体腺腫細胞の三次元アルギン酸ビーズ文化
Summary
Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.
Abstract
三次元培養法が記載されている主要な下垂体腺腫細胞をアルギネートビーズ中で増殖させます。アルギン酸塩は茶色の海藻由来ポリマーです。簡潔には、腫瘍組織を小片に切断し、コラゲナーゼ及びトリプシンで酵素消化に供します。次に、細胞懸濁液を得ました。腫瘍細胞懸濁液を1.2％アルギン酸ナトリウムと混合し、 塩化カルシウム溶液に滴下し、そしてアルギネート/細胞懸濁液を球状ビーズを形成するためのCaCl 2と接触してゲル化されます。アルギン酸ビーズに埋め込まれた細胞を、20％FBSを富化培地によって提供栄養分が供給されます。アルギン酸ビーズ内の三次元培養物は、4ヶ月まで、長期間腺腫細胞の生存率を維持します。また、細胞は、クエン酸ナトリウムでビーズを洗浄することにより、アルギン酸塩から遊離し、さらに免疫細胞化学的分析のためにカバーガラス上に播種することができます。 CELの使用リットル培養モデルは、最小限の解体とアクチン細胞骨格の固定と可視化を可能にします。要するに、アルギン酸ビーズは、下垂体腺腫細胞の維持のための信頼できる培養系を提供します。
Introduction
それらは、培養細胞および細胞-細胞コミュニケーション1の維持のための三次元構造的支持を提供するための三次元足場は、広範囲の細胞培養に使用されてきました。天然由来のポリマー材料は、I型コラーゲン、キトサンおよびアルギン酸塩を含む三次元の足場を作るために使用されています。アルギン酸塩は、褐色海藻Macrocystispyrifera（昆布）に由来する天然高分子です。このポリマーは、β-D-マンヌロン酸（M）及びα-L-グルロン酸（G）は、カルシウム及びバリウムのような特定の二価カチオンの存在下で、2及びフォーム安定なゲルの反復単位で構成されています。 塩化カルシウム（CaCl 2）溶液は、一般的にアルギン酸ビーズを形成するために、架橋試薬として使用されます。アルギン酸ソリューションは、すぐに3次元球状ゲルを形成するのCaCl 2に低下しました。アルギン酸塩溶液を細胞と混合されると、細胞は、アルギネートBに封入されていますEADS 3。
アルギン酸塩は、軟骨4を含む細胞、骨格筋芽細胞5及び神経幹細胞6の種々のカプセル化のためのマトリックスとして使用することを可能にしている特性を有します。これは、不活性材料であり、栄養素、酸素及び細胞の生存および機能を維持する代謝産物の拡散を可能にします。また、他のゲルベースの培養系とは異なり、アルギン酸ビーズ内の培養細胞は、例えば、クエン酸ナトリウムなどのカルシウムキレート化剤を使用して、骨格から遊離することができ、次いで細胞をさらに調査7のために回収することができます。
下垂体腺腫は、典型的には、低増殖速度と良性腫瘍です。ラット下垂体腺腫細胞系は、二次元系8で正常培養しました。しかし、分泌ヒト下垂体細胞腫瘍のこの文化は、効率的な開発ではありません。分散した腫瘍下垂体細胞は成長が悪いです培養において、細胞は、制限された付着および拡散を示し、細胞は、典型的には、培養皿9,10浮遊凝集体を形成します。
いくつかの試みは、酵素的、機械的分散手法11、単に機械的分散法12と腫瘍外植片10の培養を含む、腫瘍、下垂体細胞懸濁液を得るために行われています。これらのアプローチでは、別の著者は、異なる期間のために実行可能な接着培養を得ました。これらの2次元系で生き残るために腫瘍分泌細胞の能力は、腫瘍の種類とそれらの増殖率9に依存します。しかし、長期培養において、線維芽細胞の表現型を有する細胞が11,13が優勢 。本論文では、さらに以下の詳細な分析を可能にアルギン酸足場からそれらを遊離アルギン酸ビーズ中にカプセル化された下垂体腺腫細胞からの初代培養を得るための方法を説明しその細胞生物学、 例えば 、それらの細胞骨格の配置の側面。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、いくつかの重要なステップがあります。最初は、細胞培養のすべての中の栄養素とガスの拡散の同じ条件を維持するために必要とされるビーズサイズの均一性です。我々の経験では、アルギン酸ビーズを作るために21 G針の使用は、均一なビーズサイズの効率的な文化の取得を可能にします。第二の重要な要素は、針からの距離です。この距離は、カルシウム溶液の表面に…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.
Materials
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
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