Tridimensional Cultura alginato-talão de células humanas adenoma pituitário
Summary
Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.
Abstract
Um método de cultura tridimensional é descrito em que as células adenoma pituitário primário são cultivadas em drageias de alginato. O alginato é um polímero derivado de algas marinhas castanhas. Resumidamente, o tecido tumoral é cortado em pequenos pedaços e submetidas a uma digestão enzimática com colagenase e tripsina. Em seguida, uma suspensão de células é obtida. A suspensão de células tumorais é misturado com 1,2% de alginato de sódio e vertida numa solução de CaCl 2, e a suspensão de alginato / célula é gelificada em contacto com o CaCl2 para formar grânulos esféricos. As células embebidas nas drageias de alginato são fornecidos com nutrientes fornecidos pelos meios de cultura enriquecido com 20% de FBS. cultura tridimensional em drageias de alginato mantém a viabilidade das células de adenoma por longos períodos de tempo, até quatro meses. Além disso, as células podem ser libertados a partir do alginato por lavagem das pérolas com citrato de sódio e semeadas em lamelas de vidro para posteriores análises imunocitoquímicas. O uso de um celModelo L cultura permite a fixação e a visualização do citoesqueleto de actina com desorganização mínima. Em resumo, as drageias de alginato proporcionam um sistema de cultura de confiança para a manutenção de células de adenoma pituitário.
Introduction
Andaimes tridimensionais têm sido extensivamente utilizados em cultura de células porque proporcionam um suporte estrutural tridimensional de células de cultura e a manutenção de uma comunicação célula-a-célula. materiais poliméricos naturalmente derivados têm sido usados para fazer suportes tridimensionais, incluindo colagénio do tipo I, a quitosana e alginato. O alginato é um polímero natural derivado do Macrocystispyrifera de algas marinhas castanhas (alga marinha). Este polímero é composto por unidades repetidas de ácido D-manurónico β-(M) e L-α-gulurónico ácido (L) 2 e forma geles estáveis na presença de determinados catiões bivalentes, tais como cálcio e bário. Cloreto de cálcio (CaCl2) soluções são vulgarmente utilizados como o reagente de reticulação para formar as drageias de alginato. Soluções de alginato caiu em CaCl2 formar imediatamente géis esféricas tridimensionais. Quando a solução de alginato é misturada com as células, as células são encapsuladas em alginato bEADS 3.
O alginato tem propriedades que permitiram que ele seja utilizado como uma matriz para a encapsulação de uma grande variedade de células, incluindo condrócitos, mioblastos 4 5 esqueléticos e as células estaminais neurais 6. É um material inerte e permite a difusão de nutrientes, oxigénio e produtos metabólicos que manter a sobrevivência e função de células; Além disso, ao contrário de outros sistemas de cultura à base de gel, células cultivadas dentro de drageias de alginato pode também ser libertado a partir do andaime usando quelantes de cálcio, tais como citrato de sódio, e, em seguida, as células podem ser colhidas para investigações adicionais 7.
adenomas hipofisários são tipicamente tumores benignos com taxas de proliferação baixos. Linhas de células de pituitária de rato adenoma foram cultivadas com sucesso num sistema bidimensional de 8. No entanto, esta cultura de células de tumores humanos de secreção pituitária não é um desenvolvimento eficiente; células de pituitária tumor dispersos crescem malem cultura, as células exibem ligação limitada e difusão, e as células formam tipicamente agregados que flutuam na placa de cultura de 9,10.
Várias tentativas têm sido feitas para se obter uma suspensão de células de tumor da pituitária, incluindo uma abordagem enzimática e dispersão mecânica 11, uma abordagem dispersão unicamente mecânica 12 e a cultura de explantes de tumores 10. Com estas abordagens, diferentes autores obtiveram culturas aderentes viáveis para diferentes períodos de tempo. As capacidades das células secretoras do tumor para sobreviver em tais sistemas bidimensionais dependem do tipo de tumor e as suas taxas de proliferação 9. No entanto, em culturas a longo prazo, as células de fibroblastos com fenótipos predominam 11,13. Este artigo descreve um método para a obtenção de uma cultura primária de células de adenoma pituitário encapsuladas em pérolas de alginato que liberta-los ainda mais a partir do alginato de andaime que permite análises detalhadas deaspectos de sua biologia celular, por exemplo, seus arranjos do citoesqueleto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo tem várias etapas críticas. A primeira é a homogeneidade do grânulo de tamanho, o que é necessário para manter as mesmas condições de difusão de nutrientes e gases em toda a cultura de células. Na nossa experiência, a utilização de uma agulha de 21 G para fazer as esferas de alginato permite a aquisição de uma cultura eficiente de tamanho uniforme do grânulo. O segundo factor importante é a distância a partir da agulha; esta distância deve ser superior a 5 cm da solução de cálcio par…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. O. Rios for his technical assistance.
Materials
| Reagent | |||
| 199 culture medium | Invitrogen | 31100-027 | For culture, warm in a 37 °C water bath before use |
| Fetal bovine serum | PAA | A15-751 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl) piperazine-N´-2ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Collagenase type I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbean trypsin inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginic acid, From Macrocystis Pyrifera (Kelp) | Sigma | A-2158 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| Polyethylene Glycol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyde | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Bovine Serum Albumin IgG-Free | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma | P1951 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Toxic. Use gloves to handle this reagent |
| Sulfuric acid (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Highly corrosive. Use gloves to handle this reagent |
| Sodium hydroxide (NAOH) | Merck | 1.06498 | Can cause eye and skin irritation.Use gloves to handle this reagent |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma | P7280 | |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | Toxic: May cause cancer. Use gloves to handle this reagent | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Model 230300 | |
| Centrifuge | DuPont Corporation | Model sorvall TC6 | |
| shaker | Lab-line Instruments | Model 314-820 |
References
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