L'isolement, la caractérisation et de l'examen fonctionnel du Réseau de cellules gingivale immunitaire
Summary
Nous avons établi une technique pour l'isolement, la caractérisation phénotypique et l'analyse fonctionnelle des cellules immunitaires de gencive murin.
Abstract
Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.
Introduction
Tissus gingivaux entourent la dentition humaine et murine et sont constamment exposés à biofilm complexe de la dent 1. Le réseau des cellules immunitaires de police la barrière gingivale est essentiel au maintien de l'intégrité des tissus, assurant l'homéostasie avec les microbes commensaux locales et, dans le même temps, fournir une immunité efficace contre une infection pathogène 2. Pour atteindre l'homéostasie, le système immunitaire est soigneusement adaptée à l'environnement gingival création d'un réseau de cellules immunitaires très spécialisé, mais peu de détails sont connus des populations de cellules immunitaires gingivales et leur rôle dans le maintien du tissu immunité 2.
Lorsque l'homéostasie immunitaire est perturbé à la gencive, soit par augmentation de la sensibilité et / ou la présence de communautés microbiennes dysbiotic, un état inflammatoire hôte, la parodontite pose 3 4. La parodontite est une maladie inflammatoire commune, conduisant à la perte de la dent sstructures bandages en. Sous ses formes graves, il est vu dans environ 10% de la population générale 5. Disséquer les facteurs clés impliqués dans la parodontite susceptibilité et la progression est avéré difficile 6. Cependant, les modèles animaux ont été extrêmement utiles pour comprendre les mécanismes de la parodontite initiation et la progression 7. Les modèles peuvent être utilisés pour définir les populations de cellules principales et des médiateurs moléculaires qui sont essentiels pour le maintien de l'homéostasie immunitaire et le développement d'entraînement de la parodontite. Une telle perspicacité va transformer notre compréhension du contrôle spécifique de la gencive de l'homéostasie immunitaire et approfondir notre compréhension actuelle de la pathogenèse de la maladie.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique actuelle obtient avec succès un grand nombre de cellules immunitaires (à partir d'une seule souris) adapté, non seulement pour la caractérisation phénotypique, mais aussi pour des études fonctionnelles ex vivo. Un autre groupe avait déjà publié un protocole pour isoler et caractériser les cellules immunitaires gingivales murin et introduit la valeur de l'utilisation de la cytométrie de flux multicolore dans l'étude de la parodontite chez des modèles animaux 9. À…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors were funded in part by the intramural program of NIDCR (N.M.M) and supported by a Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B to J.E.K) and by a Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research grant (to J.E.K). The authors thank Teresa Wild for critically reviewing the manuscript.
Materials
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3mL |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 mL tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 mL FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
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