Summary

İzolasyon, Karakterizasyonu ve Dişeti Bağışıklık Hücre Ağı Fonksiyonel Sınav

Published: February 16, 2016
doi:

Summary

Biz izolasyon, fenotipik karakterizasyonu ve kemirgen dişetinin gelen bağışıklık hücrelerinin fonksiyonel analiz için bir teknik kurduk.

Abstract

Immune cell networks in tissues play a vital role in mediating local immunity and maintaining tissue homeostasis, yet little is known of the resident immune cell populations in the oral mucosa and gingiva. We have established a technique for the isolation and study of immune cells from murine gingival tissues, an area of constant microbial exposure and a vulnerable site to a common inflammatory disease, periodontitis. Our protocol allows for a detailed phenotypic characterization of the immune cell populations resident in the gingiva, even at steady state. Our procedure also yields sufficient cells with high viability for use in functional studies, such as the assessment of cytokine secretion ex vivo. This combination of phenotypic and functional characterization of the gingival immune cell network should aid towards investigating the mechanisms involved in oral immunity and periodontal homeostasis, but will also advance our understanding of the mechanisms involved in local immunopathology.

Introduction

Gingival dokusu, insan ve murin diş yapısına çevreleyen sürekli diş 1 kompleks biyofilm maruz kalmaktadır. Dişeti bariyeri polislik bağışıklık hücre ağı patojenik meydan 2 karşı etkili bağışıklık sağlayan, aynı zamanda, doku bütünlüğünü korumak, yerel ortakçı mikroplarla homeostazisini sağlanması ve hayati önem taşımaktadır. Homeostazı elde etmek için, bağışıklık sistemi dikkatlice henüz küçük ayrıntı dişeti bağışıklık hücre popülasyonlarının ve doku bağışıklığı 2 korunmasında rolleri bilinen bir yüksek ihtisas bağışıklık hücre ağı oluşturma dişeti çevre için hazırlanmıştır.

Immün homeostasisin gingiva de bozulduğu zaman, ya da daha büyük bir konakçı karşı duyarlılık ve / veya disbiyotik mikrobiyal topluluklar, enflamatuar bir durumun varlığı sayesinde, periodontit 3 4 ortaya çıkar. Periodontitis diş s kaybına yol açan yaygın bir inflamatuar bir hastalıktıraltlık yapılar. Onun ağır formlarında genel nüfusun 5 yaklaşık% 10'unda görülür. Periodontitis duyarlılık ve ilerlemesinde rol önemli faktörler Kesme 6 zor olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, hayvan modelleri periodontitis başlangıcında ve ilerlemesinde 7 mekanizmalarını anlamak son derece yararlı olmuştur. Modeller bağışıklık homeostazı ve periodontitis sürücü gelişimini sürdürmek için hayati önem taşımaktadır anahtar hücre popülasyonlarının ve moleküler mediatörler tanımlamak için kullanılabilir. Böyle bir anlayış bağışıklık homeostazı dişeti özgü kontrol anlayışımızı dönüşümü ve hastalık patogenezinde güncel anlamanız açısından çok önemlidir.

Protocol

Bu protokol açıklanan tüm deneysel prosedürleri gerekli kurallar takip ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi, NIDCR / NIH tarafından kabul edildi. 1. Peşin hazırlayın Tam ortam hazırlayın: RPMI 2 mM L-glutamin, 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve% 10 FBS ile takviye edilmiştir. 7.5 ug DNaz ile desteklenmiş RPMI medya 50 ml (taze olun her zaman buz üzerinde tutmak): DNase ortamını hazırlayın. DNaz medya artı 3.2 mg / kollajenaz Tipi …

Representative Results

(- / – Şekil 2A – C LFA vs WT) protokolünün uygulanmasını göstermek için, bağışıklık hücresi ile ve periodontitis olmayan farelerin dişetinde ağı inceleyen temsili sonuçlar göstermektedir. Temsilcisi FACS araziler dişeti (Şekil 2A, 2C) canlı CD45 + hematopoetik hücreler gösterir. Bu protokol ile bağışıklık hücrelerinin izolasyonu ve işleme ex vivo uyarılması …

Discussion

Mevcut teknik, başarılı bir şekilde uygun bir (tek bir fare), bağışıklık hücrelerinin büyük sayısını verir, sadece fenotipik karakterizasyon için değil, aynı zamanda fonksiyonel çalışmalar için ex vivo. Başka bir grup daha önce izole ve fare dişeti bağışıklık hücreleri karakterize bir protokol yayınlamıştır ve hayvan modellerinde 9 periodontitis çalışmada flow sitometri çok renkli kullanarak değerini tanıştırmıştı. Önemli sorun giderme Bu protokolde anah…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Authors were funded in part by the intramural program of NIDCR (N.M.M) and supported by a Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship (097820/Z/11/B to J.E.K) and by a Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research grant (to J.E.K). The authors thank Teresa Wild for critically reviewing the manuscript.

Materials

Fine Scissors Fine science tools 14058-11
Scalpel Handle #3 Fine science tools 10003-12
Scalpel Blades #10 Fine science tools 10010-00 Sterile
Splinter Forceps Integra Miltex 6-304
Needles with regular bevel  BD Medical 305109 27G, 12.7 mm length
Monoject syringes Covidien 8881513934 Luer-lock tip, 3mL
PBS, pH 7.4 Life Technologies 10010-049 Without Calcium and Magnesium
RPMI 1640 Lonza 12-167F Without L-glutamine
DNase I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25-1G
Collagenase type IV Gibco (by Life technologies) 17104-019
Fetal Bovine Serum Gemini Bio-products 100-106
Gentamicin 50 mg/ml Quality biological 120-098-661EA
Pen Strep Gibco (by Life technologies) 15140-122
L-Glutamine Gibco (by Life technologies) 25030-081
0.5M EDTA pH 8.0 Quality biological 351-027-721EA
50 mL tubes Corning 352070 Polypropylene, sterile
70 μM Cell Strainers Corning 352350
Petri dishes Corning 351029 Sterile
5 mL FACS tubes Corning 352052 Sterile
BD GolgiPlug BD Biosciences 555029 Contains brefeldin A solution
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Ionomycin Calcium Salt Sigma-Aldrich 13909
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S4521
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit Life Technologies L34957
Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 eBioscience 56-0451-82
Anti-Mouse CD4 eFluor 450 eBioscience 48-0042-82
Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 eBioscience 47-5961-82
Anti-Mouse gamma delta TCR FITC eBioscience 11-5711-82
Anti-Mouse IL-17A APC eBioscience 12-7311-82
Anti-Mouse IFN-γ PE eBioscience 11-5931-82
Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 eBioscience 25-5941-82
Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 eBioscience 47-0902-82
Anti-Mouse CD3e FITC eBioscience 11-0031-82
Anti-Mouse CD19 FITC eBioscience 11-0193-82
Anti-Mouse CD11b FITC eBioscience 11-0112-82
Anti-Mouse CD11c FITC eBioscience 11-0114-82
Anti-Mouse TCR beta FITC eBioscience 11-5961-82
Anti-Mouse Ly-6G FITC eBioscience 11-5931-82
Anti-Mouse Ly-6C FITC BD Pharmingen 553104

References

  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Belkaid, Y., Naik, S. Compartmentalized And Systemic Control Of Tissue Immunity By Commensals. Nat Immunol. 14, 646-653 (2013).
  3. Darveau, R. P. Periodontitis: A Polymicrobial Disruption Of Host Homeostasis. Nat Rev Microbiol. 8, 481-490 (2010).
  4. Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
  5. Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
  6. Moutsopoulos, N. M., Lionakis, M. S., Hajishengallis, G. Inborn Errors In Immunity: Unique Natural Models To Dissect Oral Immunity. J Dent Res. , (2015).
  7. Hajishengallis, G., Lamont, R. J., Graves, D. T. The Enduring Importance Of Animal Modelsin Understanding Periodontal Disease. Virulence. 6, 229-235 (2015).
  8. Sharrow, S. O., Coligan, J. E., et al. Analysis Of Flow Cytometry Data. Current Protocols In Immunology. , (2001).
  9. Arizon, M., et al. Langerhans Cells Down-Regulate Inflammation-Driven Alveolar Bone Loss. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 7043-7048 (2012).
  10. Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
  11. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).

Play Video

Cite This Article
Dutzan, N., Abusleme, L., Konkel, J. E., Moutsopoulos, N. M. Isolation, Characterization and Functional Examination of the Gingival Immune Cell Network. J. Vis. Exp. (108), e53736, doi:10.3791/53736 (2016).

View Video