النخابية ثمرة ثقافة الفحص و<em> فيفو السابقين</em> تقييم هجرة الخلايا المشتقة النخابية-
Summary
Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.
Abstract
طبقة واحدة من خطوط الخلايا النخابية قلب، وتوفير عوامل نظير الصماوي التي تحفز انتشار cardiomyocyte والمساهمة مباشرة الأسلاف القلب والأوعية الدموية خلال تطوير والمرض. في حين أن عددا من العوامل قد تورطت في الخلية (EPDC) تعبئة المستمدة النخاب، والآليات التي تحكم هجرتهم اللاحقة والتمايز وغير مفهومة. هنا، نقدم في المختبر والمجراة سابقا استراتيجيات لدراسة EPDC الحركة والتمايز. أولا، نحن تصف طريقة للحصول على خلايا النخابية الأولية من خلال ثقافة ثمرة من قلب فأر الجنينية. نحن أيضا إدخال بروتوكول مفصلة لتقييم الهجرة ثلاثية الأبعاد من EPDC وصفت في نظام الثقافة الجهاز. ونحن نقدم أدلة استخدام هذه التقنيات التي الحذف الوراثي للعوامل النسخ المتعلقة myocardin في النخاب خفف الهجرة EPDC. يخدم هذا النهج كمنصة لتقييم معدلات مرشح EPDCويمكن استخدام البيولوجيا وتطوير شاشات الوراثية والكيميائية لتحديد المنظمين رواية من تعبئة EPDC التي قد تكون مفيدة للإصلاح القلب.
Introduction
والنخاب هو عبارة عن طبقة واحدة من الخلايا الظهارية التي خطوط القلب وتأثيرات القلب التنمية، النضج والإصلاح. من خلال التبادل المنسق للغاية من إشارات نظير الصماوي، والحوار الحميم بين عضلة القلب والنخاب أمر لا غنى عنه لنمو القلب وتشكيل غير العضلية-الأنساب القلب 1. الخلايا المشتقة النخابية (EPDC) الخروج من مجموعة فرعية من الخلايا النخابية من خلال الظهارة إلى الوسيطة الانتقالية (EMT) 2، وغزو الفضاء تحت النخاب وعضلة القلب الأساسي، وتفرق إلى حد كبير إلى خلايا جدارية الأوعية الدموية التاجية والخلايا الليفية القلب، ول بدرجة أقل، والخلايا البطانية والعضلية 3-9.
وقد نسبت آليات تنظيم EMT النخابية والغزو EPDC إلى اتخاذ إجراءات منسقة من مختلف الجزيئات بما في ذلك بروابط يفرز 10-13، مستقبلات سطح الخلية والجزيئات التصاق 14،15، regulators من قمية-القاعدية القطبية 16،17، GTPases صغيرة 18،19، والنسخ عوامل 2،20،21. في حين أن العديد من المؤثرات الجزيئية للهجرة EPDC تم تعريفها، فهم أفضل من الإشارات الفيزيولوجية التي تحفز تعبئة EPDC في الجنين قد تسريع عملية تطوير استراتيجيات لمعالجة هذه العملية عند البالغين لتحسين إصلاح القلب.
الدراسات التي تهدف إلى تحديد المنظمين جديدة للتعبئة EPDC تعتمد على تنقية هذه الفئة من السكان خلية أو تتبع هجرة الخلايا النخابية الفردية. واحد أو مجموعة من الجينات علامة، بما في ذلك WT1، Tcf21، Tbx18، و / أو Aldh1a2، ويستخدم عادة لتحديد النخاب الجنين 1. ومع ذلك، فإن استخدام هذه العلامات لتتبع هجرة EPDC ليس الأمثل كتعبير عن علامات النخابية يتراجع على مسار التنمية القلب، وغالبا ما فقدت عندما تمر خلايا النخابية transdifferentiation إلى خلايا اللحمة المتوسطة.
تطبيق نظام لجنة المساواة العرقية / loxP، بالتزامن مع الصحفيين لتعقب النسب وكان ومفيدة في وضع العلامات بشكل دائم النخاب ونسله خلال تطوير القلب، وبعد الإصابة الدماغية عند البالغين 7،22،23. تم إنشاء عدة خطوط لجنة المساواة العرقية المقيدة النخابية وتستخدم على نطاق واسع لتسمية EPDC واستراتيجيات حذف الجينات المشروط 1. وقد أدت هذه الدراسات إلى توصيف مختلف الأنساب النخابية، وتحديد وسطاء الحرجة من EPDC الحركة والتمايز. ومع ذلك، تشير الأدلة المتراكمة أيضا النخاب هو عدد السكان غير متجانسة من الخلايا الاصلية 4،24،25. وهكذا، فقط مجموعة فرعية من الخلايا النخابية سوف تستهدف استخدام برنامج تشغيل لجنة المساواة العرقية معين.
من أجل تسمية النخاب كامل بغض النظر عن لجنة المساواة العرقية خصوصية، وقد استخدمت عددا من المختبرات طريق مسدود ثمرةأنظمة البنية أو خارج الجسم الحي أساليب الثقافة الجهاز لعزل بأمانة أو تسمية الخلايا النخابية دون الاعتماد على التعبير عن النسب الجيني علامات 26-28. لدراسات الهجرة خارج الجسم، يتم عزل قلوب الأجنة قبل EMT النخابية ومثقف في المتوسط تستكمل مع بروتين الفلورية الخضراء (GFP) -expressing اتش (إعلان / GFP) 9،18. يسمح هذا النهج لوضع العلامات الفعال للالنخاب بأكمله بدلا من مجموعة فرعية من الخلايا عن طريق إعادة التركيب بوساطة لجنة المساواة العرقية. ويتعرض الثقافات القلب في وقت لاحق إلى محرضات معروفة من EMT لتحفيز تعبئة EPDC 28،29. فيفو السابقين والحية التحليلات تكملها في المختبر الثقافات يزدرع النخابية، والتي هي نهج مفيد بشكل خاص لاستكشاف آليات مفصلة القيادة الهجرة EPDC.
هنا، نحن تصف طرق لعزل خلايا النخابية الأولية للدراسات في المختبر من epicardiآل EMT، وكذلك نظام الجهاز ثقافة للخارج الحي تحليلات EPDC الحركة. لقد أثبتنا مؤخرا فائدة ومتانة هذه الطريقة عن طريق تحوير وراثيا عامل المتعلقة myocardin النسخ (MRTF) / مصل عامل استجابة (SRF) مما يشير إلى محور للتلاعب الهجرة على أساس الأكتين من EPDC 9. بينما النتائج التي توصلنا إليها تبرز واحدة مسار الإشارات اللازمة لتنظيم الهجرة EPDC، وهذه الأساليب هي مناسبة لكشف الآليات التي تنسق بشكل جماعي EPDC الهجرة والتمايز. وعلاوة على ذلك، يمكن تنفيذ يزدرع والسابقين نظم الاستزراع المجراة في الشاشات وظيفية لتحديد المنظمين جديدة للتعبئة EPDC للتطبيقات العلاجية في تجديد القلب.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن هنا الخطوط العريضة طرق مفصلة لعزل الخلايا النخابية الأولية التي كتبها ثمرة وتتبع هجرة EPDC في فيفو السابقين الثقافات القلب. للثقافات ثمرة، والوقت المناسب لإزالة القلب المنضب النخاب يختلف قليلا بين التجارب. ينصح الرصد الدوري لإإكسبلنتس بعد الحضانة بين عشية و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد EMS من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) [رقم منحة R01HL120919]. جمعية القلب الأمريكية [عدد المنح 10SDG4350046]. جامعة روتشستر جائزة CTSA من المعاهد الوطنية للصحة [عدد المنح UL1 TR000042]. وأموال بدء التشغيل من االعاب CVRI. وأيد MAT في جزء من منحة إلى جامعة روتشستر مدرسة الطب وطب الأسنان من مبادرة معهد هوارد هيوز الطبي ميد حيز غراد. وجائزة المؤسسي روث L. كيرشتاين القومي للبحوث الخدمة من المعاهد الوطنية للصحة [رقم منحة GM068411].
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 x 75 x 1mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
References
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is required for cardiovascular progenitor cell formation through transcriptional control of Snail and E-cadherin. Nat Genet. 42, 89-93 (2010).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
- Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
- Wilm, B., Ipenberg, A., Hastie, N. D., Burch, J. B., Bader, D. M. The serosal mesothelium is a major source of smooth muscle cells of the gut vasculature. Development. 132, 5317-5328 (2005).
- Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454, 109-113 (2008).
- Dettman, R. W., Denetclaw, W., Ordahl, C. P., Bristow, J. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev Biol. 193, 169-181 (1998).
- Trembley, M. A., Velasquez, L. S., de Mesy Bentley, K. L., Small, E. M. Myocardin-related transcription factors control the motility of epicardium-derived cells and the maturation of coronary vessels. Development. 142, 21-30 (2015).
- Mellgren, A. M., et al. Platelet-derived growth factor receptor beta signaling is required for efficient epicardial cell migration and development of two distinct coronary vascular smooth muscle cell populations. Circ Res. 103, 1393-1401 (2008).
- von Gise, A., et al. WT1 regulates epicardial epithelial to mesenchymal transition through beta-catenin and retinoic acid signaling pathways. Dev Biol. 356, 421-431 (2011).
- Lavine, K. J., et al. Endocardial and Epicardial Derived FGF Signals Regulate Myocardial Proliferation and Differentiation In Vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
- Sanchez, N. S., Barnett, J. V. TGFbeta and BMP-2 regulate epicardial cell invasion via TGFbetaR3 activation of the Par6/Smurf1/RhoA pathway. Cell Signal. 24, 539-548 (2012).
- Dettman, R. W., Pae, S. H., Morabito, C., Bristow, J. Inhibition of 4-integrin stimulates epicardial-mesenchymal transformation and alters migration and cell fate of epicardially derived mesenchyme. Dev Biol. 257, 315-328 (2003).
- Rhee, D. Y., et al. Connexin 43 regulates epicardial cell polarity and migration in coronary vascular development. Development. 136, 3185-3193 (2009).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Hirose, T., et al. PAR3 is essential for cyst-mediated epicardial development by establishing apical cortical domains. Development. 133, 1389-1398 (2006).
- Baek, S. T., Tallquist, M. D. Nf1 limits epicardial derivative expansion by regulating epithelial to mesenchymal transition and proliferation. Development. 139, 2040-2049 (2012).
- Lu, J., et al. Coronary smooth muscle differentiation from proepicardial cells requires rhoA-mediated actin reorganization and p160 rho-kinase activity. Dev Biol. 240, 404-418 (2001).
- Combs, M. D., Braitsch, C. M., Lange, A. W., James, J. F., Yutzey, K. E. NFATC1 promotes epicardium-derived cell invasion into myocardium. Development. 138, 1747-1757 (2011).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139, 2139-2149 (2012).
- Zhou, B., von Gise, A., Ma, Q., Hu, Y. W., Pu, W. T. Genetic fate mapping demonstrates contribution of epicardium-derived cells to the annulus fibrosis of the mammalian heart. Dev Biol. 338, 251-261 (2010).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
- Singh, M., Epstein, J. Epicardial Lineages and Cardiac Repair. Journal of Developmental Biology. 1, 141-158 (2013).
- Braitsch, C. M., Combs, M. D., Quaggin, S. E., Yutzey, K. E. Pod1/Tcf21 is regulated by retinoic acid signaling and inhibits differentiation of epicardium-derived cells into smooth muscle in the developing heart. Dev Biol. 368, 345-357 (2012).
- Austin, A. F., Compton, L. A., Love, J. D., Brown, C. B., Barnett, J. V. Primary and immortalized mouse epicardial cells undergo differentiation in response to TGFbeta. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 366-376 (2008).
- Kim, J., Rubin, N., Huang, Y., Tuan, T. L., Lien, C. L. In vitro culture of epicardial cells from adult zebrafish heart on a fibrin matrix. Nat Protoc. 7, 247-255 (2012).
- Compton, L. A., Potash, D. A., Mundell, N. A., Barnett, J. V. Transforming growth factor-beta induces loss of epithelial character and smooth muscle cell differentiation in epicardial cells. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 82-93 (2006).
- Smith, C. L., Baek, S. T., Sung, C. Y., Tallquist, M. D. Epicardial-derived cell epithelial-to-mesenchymal transition and fate specification require PDGF receptor signaling. Circ Res. 108, 15-26 (2011).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. JOVE. 2, (2007).
- Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 32, 1026-1035 (2014).
- Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
- Takeichi, M., Nimura, K., Mori, M., Nakagami, H., Kaneda, Y. The transcription factors Tbx18 and Wt1 control the epicardial epithelial-mesenchymal transition through bi-directional regulation of Slug in murine primary epicardial cells. PloS one. 8, e57829 (2013).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39, 75-85 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Moore, A. W., McInnes, L., Kreidberg, J., Hastie, N. D., Schedl, A. YAC complementation shows a requirement for Wt1 in the development of epicardium, adrenal gland and throughout nephrogenesis. Development. 126, 1845-1857 (1999).
- Kim, J., et al. PDGF signaling is required for epicardial function and blood vessel formation in regenerating zebrafish hearts. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17206-17210 (2010).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, 1420-1428 (2009).
- Dong, X. R., Maguire, C. T., Wu, S. P., Majesky, M. W. Chapter 9 Development of Coronary Vessels. Methods in Enzymology. 445, 209-228 (2008).
- Ruiz-Villalba, A., Ziogas, A., Ehrbar, M., Perez-Pomares, J. M. Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of heart fibroblast progenitors. PLoS One. 8, e53694 (2013).
- Garriock, R. J., Mikawa, T., Yamaguchi, T. P. Isolation and culture of mouse proepicardium using serum-free conditions. Methods. 66, 365-369 (2014).
- Smart, N., Riley, P. Derivation of epicardium-derived progenitor cells (EPDCs) from adult epicardium. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2009).
- Zhou, B., Pu, W. T. Isolation and characterization of embryonic and adult epicardium and epicardium-derived cells. Methods Mol Biol. 843, 155-168 (2012).
- Morabito, C. J., Dettman, R. W., Kattan, J., Collier, J. M., Bristow, J. Positive and negative regulation of epicardial-mesenchymal transformation during avian heart development. Dev Biol. 234, 204-215 (2001).
- Grieskamp, T., Rudat, C., Ludtke, T. H., Norden, J., Kispert, A. Notch signaling regulates smooth muscle differentiation of epicardium-derived cells. Circ Res. 108, 813-823 (2011).
