Epicardiale uitgroei Cultuur en Assay<em> Ex Vivo</em> Evaluatie van Epicardial-afgeleide Cell Migratie
Summary
Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.
Abstract
Een enkele laag van epicardiale cellijnen het hart, waardoor paracriene factoren die cardiomyocyt proliferatie stimuleren en rechtstreeks bij cardiovasculaire progenitoren tijdens ontwikkeling en ziekte. Hoewel een aantal factoren zijn betrokken bij cel-epicard afgeleide (EPDC) mobiliseren, zijn de mechanismen die de latere migratie en differentiatie slecht begrepen. Hier presenteren we in vitro en ex vivo strategieën EPDC motiliteit en differentiatie te bestuderen. Ten eerste beschrijven we een methode voor het verkrijgen primaire epicardiale cellen door uitgroei Cultuur van de embryonale muis hart. We introduceren ook een gedetailleerd protocol om driedimensionale migratie van gelabelde EPDC beoordelen in een orgaan kweeksysteem. Wij leveren het bewijs met behulp van deze technieken die genetische deletie van-myocardin gerelateerde transcriptiefactoren in het epicard verzwakt EPDC migratie. Deze aanpak dient als een platform om de kandidaat-modifiers van EPDC evaluerenbiologie en kunnen worden gebruikt om genetische of chemische screens voor nieuwe regulatoren van EPDC mobilisatie die nuttig zijn voor cardiale regeneratie kan zijn kaart te brengen.
Introduction
Het epicard is een enkele laag van mesotheelcellen lijnen die het hart en effecten cardiale ontwikkeling, rijping en reparatie. Via een sterk gecoördineerde uitwisseling van paracriene signalen, de intieme dialoog tussen het myocardium en epicardium onontbeerlijk cardiale groei en de vorming van niet-cardiale myocyten lineages 1. -Epicardiale afgeleide cellen (EPDC) komen uit een subset van epicardiale cellen door een epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) 2, binnenvallen subepicardiale ruimte en onderliggende myocardium en differentiëren grotendeels in hart- mural cellen en fibroblasten, en een mindere mate, endotheelcellen en cardiomyocyten 3-9.
De mechanismen reguleren epicardiale EMT en EPDC invasie werden toegeschreven aan de gecoördineerde actie van verschillende moleculen, waaronder uitgescheiden liganden 10-13, celoppervlak receptoren en adhesiemoleculen 14,15, reguLators van apicale-basale polariteit 16,17, kleine GTPases 18,19 en transcriptiefactoren 2,20,21. Hoewel veel van de moleculaire effectoren van EPDC migratie zijn gedefinieerd, een beter begrip van de fysiologische signalen die EPDC mobilisatie stimuleren het embryo kan de ontwikkeling van strategieën versnellen dit proces te manipuleren in de volwassen verbeterde cardiale regeneratie.
Studies gericht op het identificeren van nieuwe regulatoren van EPDC mobilisatie een beroep doen op de zuivering van deze cel populatie of het opsporen van de migratie van individuele epicardiale cellen. Een of meer markergenen, waaronder WT1, Tcf21, Tbx18 en / of Aldh1a2, wordt vaak gebruikt om de foetale epicard 1 te identificeren. Het gebruik van deze merkers te sporen migratie EPDC niet optimaal expressie van epicardiale merkers afneemt in de loop van de ontwikkeling van het hart en wordt vaak verloren als epicardiale cellen transdif ondergaanferentiatie in mesenchymale cellen.
De toepassing van de Cre / loxP-systeem, in combinatie met-lineage tracing verslaggevers, is nuttig geweest in permanent het labelen van de epicard en de nakomelingen tijdens de ontwikkeling van het hart en de volgende ischemische schade in de volwassen 7,22,23. Verschillende-epicardiale beperkt Cre lijnen zijn gegenereerd en worden op grote schaal gebruikt om EPDC labelen en voor conditionele gen deletie strategieën 1. Deze studies hebben geleid tot de identificatie van verschillende epicardiale lijnen en de identificatie van kritische mediatoren van EPDC motiliteit en differentiatie. Echter, de opslag bewijs suggereert ook het epicard is een heterogene populatie van voorlopercellen 4,24,25. Derhalve zal slechts een deel van epicardiale cellen worden gericht met een bepaalde Cre driver.
Om de gehele epicard ongeacht Cre specificiteit label, hebben een aantal laboratoria uitgroei cul benuttuur systemen of ex vivo orgaan kweekmethoden trouw isoleren of het etiket epicardiale cellen zonder afhankelijk van de expressie van een genetische markers lijn 26-28. Voor ex vivo migratie studies, zijn embryonale harten die voorafgaand aan epicardiale EMT en gekweekt in medium, aangevuld met een groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen adenovirus (Ad / GFP) 9,18. Deze benadering maakt een efficiënte labeling van de gehele epicard plaats van een subset van cellen door Cre gemedieerde recombinatie. Hart culturen worden vervolgens blootgesteld aan bekende inductoren van EMT om de mobilisatie van EPDC 28,29 stimuleren. Ex vivo en in vivo analyses worden aangevuld door in vitro epicardiale explantatie culturen, die een bijzonder nuttige benadering voor het verkennen van gedetailleerde mechanismen achter EPDC migratie.
We beschrijven werkwijzen voor het isoleren primaire epicardiale cellen in vitro studies epicardial EMT, alsmede een orgaan kweeksysteem voor ex vivo analyses van EPDC motiliteit. We hebben onlangs aangetoond dat het nut en de robuustheid van deze methode door genetisch moduleren van de myocardin-gerelateerde transcriptiefactor (MRTF) / serum response factor (SRF) signalering as-actine gebaseerde migratie van EPDC 9 manipuleren. Terwijl onze bevindingen benadrukken een signaalroute die nodig zijn voor het regelen EPDC migratie, deze werkwijzen zijn geschikt voor het ontrafelen van de mechanismen die gezamenlijk orkestreren EPDC migratie en differentiatie. Bovendien zou het explantaat en ex vivo kweeksystemen in functionele screens worden uitgevoerd om nieuwe regulatoren van EPDC mobilisatie te identificeren voor therapeutische toepassingen in cardiale regeneratie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier schetsen we gedetailleerde methoden om primaire epicardiale cellen te isoleren door uitgroei en volgen EPDC migratie in ex vivo hart culturen. Voor uitgroei culturen, het juiste moment om de epicard uitgeputte hart te verwijderen verschilt enigszins tussen de experimenten. Periodieke controle van de explantaten na een nacht incubatie wordt aanbevolen om te peilen naar de omvang van de epicardiale uitgroei en het hart uit te pakken voordat fibroblasten verschijnen. Om de zuiverheid te garanderen, moet harte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
EMS werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) [licentienummer R01HL120919]; de American Heart Association [subsidie aantal 10SDG4350046]; University of Rochester CTSA onderscheiding van de NIH [toekenningsnummer UL1 TR000042]; en inbedrijfstelling fondsen van de Aab CVRI. MAT werd mede ondersteund door een subsidie van de Universiteit van Rochester School of Medicine en Tandheelkunde van het Howard Hughes Medical Institute Med-Into-Grad Initiative; en een Institutioneel Ruth L. Kirschstein National Research Service Award van de NIH [toekenningsnummer GM068411].
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH3002201 | DMEM |
| Hanks' Balanced Salt Solution | Hyclone | SH3003102 | HBSS |
| Medium 199 | Hyclone | SH3025301 | M199 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline | Hyclone | SH3002802 | DPBS |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | FBS |
| Penicillin/Streptomycin Solution | Hyclone | SV30010 | |
| Corning Biocoat Collagen I, 4-Well Culture Slides | Corning | 354557 | |
| Multiwell 24-well plates | Falcon | 08-772-1 | |
| Dissecting microscope | Leica | M50 | Equipped with Leica KL300 LED might source |
| Confocal miscroscope | Olympus | 1X81 | Equipped with muli-argon laser 405/488/515, FV10-MCPSU laser 405/440/635, 559 laser, and mercury lamp |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Transforming growth factor beta 1 | R&D Systems | 100-B-001 | TGF-β1 |
| Platelet-derived growth factor BB | R&D Systems | 220-BB-010 | PDGF-BB |
| Trizol Reagent | Applied Biosystems | 15596-026 | Caution, hazardous material |
| TURBO DNA-free Kit | Life Technologies | AM1907 | DNaseI |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891 | |
| UltraPure Glycogen | Life Technologies | 10814-010 | |
| SYBR Green | BioRad | 170-8880 | |
| Protease inhibtor cocktail tablets | Roche | 11836170001 | |
| Alexa Goat-anti-rabbit 488 | Life Technologies | A11008 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-rabbit 594 | Life Technologies | A-11012 | Secondary antibody |
| Alexa Goat anti-mouse 594 | Life Technologies | A-11005 | Secondary antibody |
| Mouse anti-smooth muscle alpha actin, Cy3-conjugated | Sigma-Aldrich | C6198 | monoclonal antibody, clone 1A4 |
| Mouse anti-Wilms tumor 1 (WT1) | Life Technologies | MA1-46028 | monoclonal antibody, clone 6F-H2 |
| Rabbit anti-ZO1 | Life Technologies | 40-2200 | polyclonal antibody |
| Rabbit anti-Collagen Type 4 | Millipore | AB756P | polyclonal antibody |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride | Life Technologies | D1306 | DAPI |
| Fluorescent mounting medium | DAKO | S3023 | |
| 16% Paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA diluted to 4% in DPBS. Caution, hazardous material |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue Freezing Medium | Triangle Biomedical Sciences | TFM-B | |
| Pap pen | DAKO | S2002 | |
| Disposable mictrotome blades | Sakura Finetek | 4689 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1358W | positively charged, 25 x 75 x 1mm |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Disposable base molds | Fisher Scientific | 22-363-553 | |
| Ketamine | Hospira | NDC 0409-2051-05 | |
| Xylazine | Akorn | NADA 139-236 |
References
- von Gise, A., Pu, W. T. Endocardial and epicardial epithelial to mesenchymal transitions in heart development and disease. Circ Res. 110, 1628-1645 (2012).
- Martinez-Estrada, O. M., et al. Wt1 is required for cardiovascular progenitor cell formation through transcriptional control of Snail and E-cadherin. Nat Genet. 42, 89-93 (2010).
- Gittenberger-de Groot, A. C., Vrancken Peeters, M. P., Mentink, M. M., Gourdie, R. G., Poelmann, R. E. Epicardium-derived cells contribute a novel population to the myocardial wall and the atrioventricular cushions. Circ Res. 82, 1043-1052 (1998).
- Katz, T. C., et al. Distinct compartments of the proepicardial organ give rise to coronary vascular endothelial cells. Dev Cell. 22, 639-650 (2012).
- Mikawa, T., Gourdie, R. G. Pericardial mesoderm generates a population of coronary smooth muscle cells migrating into the heart along with ingrowth of the epicardial organ. Dev Biol. 174, 221-232 (1996).
- Wilm, B., Ipenberg, A., Hastie, N. D., Burch, J. B., Bader, D. M. The serosal mesothelium is a major source of smooth muscle cells of the gut vasculature. Development. 132, 5317-5328 (2005).
- Zhou, B., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454, 109-113 (2008).
- Dettman, R. W., Denetclaw, W., Ordahl, C. P., Bristow, J. Common epicardial origin of coronary vascular smooth muscle, perivascular fibroblasts, and intermyocardial fibroblasts in the avian heart. Dev Biol. 193, 169-181 (1998).
- Trembley, M. A., Velasquez, L. S., de Mesy Bentley, K. L., Small, E. M. Myocardin-related transcription factors control the motility of epicardium-derived cells and the maturation of coronary vessels. Development. 142, 21-30 (2015).
- Mellgren, A. M., et al. Platelet-derived growth factor receptor beta signaling is required for efficient epicardial cell migration and development of two distinct coronary vascular smooth muscle cell populations. Circ Res. 103, 1393-1401 (2008).
- von Gise, A., et al. WT1 regulates epicardial epithelial to mesenchymal transition through beta-catenin and retinoic acid signaling pathways. Dev Biol. 356, 421-431 (2011).
- Lavine, K. J., et al. Endocardial and Epicardial Derived FGF Signals Regulate Myocardial Proliferation and Differentiation In Vivo. Dev Cell. 8, 85-95 (2005).
- Sanchez, N. S., Barnett, J. V. TGFbeta and BMP-2 regulate epicardial cell invasion via TGFbetaR3 activation of the Par6/Smurf1/RhoA pathway. Cell Signal. 24, 539-548 (2012).
- Dettman, R. W., Pae, S. H., Morabito, C., Bristow, J. Inhibition of 4-integrin stimulates epicardial-mesenchymal transformation and alters migration and cell fate of epicardially derived mesenchyme. Dev Biol. 257, 315-328 (2003).
- Rhee, D. Y., et al. Connexin 43 regulates epicardial cell polarity and migration in coronary vascular development. Development. 136, 3185-3193 (2009).
- Wu, M., et al. Epicardial spindle orientation controls cell entry into the myocardium. Dev Cell. 19, 114-125 (2010).
- Hirose, T., et al. PAR3 is essential for cyst-mediated epicardial development by establishing apical cortical domains. Development. 133, 1389-1398 (2006).
- Baek, S. T., Tallquist, M. D. Nf1 limits epicardial derivative expansion by regulating epithelial to mesenchymal transition and proliferation. Development. 139, 2040-2049 (2012).
- Lu, J., et al. Coronary smooth muscle differentiation from proepicardial cells requires rhoA-mediated actin reorganization and p160 rho-kinase activity. Dev Biol. 240, 404-418 (2001).
- Combs, M. D., Braitsch, C. M., Lange, A. W., James, J. F., Yutzey, K. E. NFATC1 promotes epicardium-derived cell invasion into myocardium. Development. 138, 1747-1757 (2011).
- Acharya, A., et al. The bHLH transcription factor Tcf21 is required for lineage-specific EMT of cardiac fibroblast progenitors. Development. 139, 2139-2149 (2012).
- Zhou, B., von Gise, A., Ma, Q., Hu, Y. W., Pu, W. T. Genetic fate mapping demonstrates contribution of epicardium-derived cells to the annulus fibrosis of the mammalian heart. Dev Biol. 338, 251-261 (2010).
- Zhou, B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest. 121, 1894-1904 (2011).
- Singh, M., Epstein, J. Epicardial Lineages and Cardiac Repair. Journal of Developmental Biology. 1, 141-158 (2013).
- Braitsch, C. M., Combs, M. D., Quaggin, S. E., Yutzey, K. E. Pod1/Tcf21 is regulated by retinoic acid signaling and inhibits differentiation of epicardium-derived cells into smooth muscle in the developing heart. Dev Biol. 368, 345-357 (2012).
- Austin, A. F., Compton, L. A., Love, J. D., Brown, C. B., Barnett, J. V. Primary and immortalized mouse epicardial cells undergo differentiation in response to TGFbeta. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 366-376 (2008).
- Kim, J., Rubin, N., Huang, Y., Tuan, T. L., Lien, C. L. In vitro culture of epicardial cells from adult zebrafish heart on a fibrin matrix. Nat Protoc. 7, 247-255 (2012).
- Compton, L. A., Potash, D. A., Mundell, N. A., Barnett, J. V. Transforming growth factor-beta induces loss of epithelial character and smooth muscle cell differentiation in epicardial cells. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 82-93 (2006).
- Smith, C. L., Baek, S. T., Sung, C. Y., Tallquist, M. D. Epicardial-derived cell epithelial-to-mesenchymal transition and fate specification require PDGF receptor signaling. Circ Res. 108, 15-26 (2011).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos. JOVE. 2, (2007).
- Witty, A. D., et al. Generation of the epicardial lineage from human pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 32, 1026-1035 (2014).
- Iyer, D., et al. Robust derivation of epicardium and its differentiated smooth muscle cell progeny from human pluripotent stem cells. Development. 142, 1528-1541 (2015).
- Takeichi, M., Nimura, K., Mori, M., Nakagami, H., Kaneda, Y. The transcription factors Tbx18 and Wt1 control the epicardial epithelial-mesenchymal transition through bi-directional regulation of Slug in murine primary epicardial cells. PloS one. 8, e57829 (2013).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques. 39, 75-85 (2005).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Moore, A. W., McInnes, L., Kreidberg, J., Hastie, N. D., Schedl, A. YAC complementation shows a requirement for Wt1 in the development of epicardium, adrenal gland and throughout nephrogenesis. Development. 126, 1845-1857 (1999).
- Kim, J., et al. PDGF signaling is required for epicardial function and blood vessel formation in regenerating zebrafish hearts. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17206-17210 (2010).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Invest. 119, 1420-1428 (2009).
- Dong, X. R., Maguire, C. T., Wu, S. P., Majesky, M. W. Chapter 9 Development of Coronary Vessels. Methods in Enzymology. 445, 209-228 (2008).
- Ruiz-Villalba, A., Ziogas, A., Ehrbar, M., Perez-Pomares, J. M. Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of heart fibroblast progenitors. PLoS One. 8, e53694 (2013).
- Garriock, R. J., Mikawa, T., Yamaguchi, T. P. Isolation and culture of mouse proepicardium using serum-free conditions. Methods. 66, 365-369 (2014).
- Smart, N., Riley, P. Derivation of epicardium-derived progenitor cells (EPDCs) from adult epicardium. Curr Protoc Stem Cell Biol. , (2009).
- Zhou, B., Pu, W. T. Isolation and characterization of embryonic and adult epicardium and epicardium-derived cells. Methods Mol Biol. 843, 155-168 (2012).
- Morabito, C. J., Dettman, R. W., Kattan, J., Collier, J. M., Bristow, J. Positive and negative regulation of epicardial-mesenchymal transformation during avian heart development. Dev Biol. 234, 204-215 (2001).
- Grieskamp, T., Rudat, C., Ludtke, T. H., Norden, J., Kispert, A. Notch signaling regulates smooth muscle differentiation of epicardium-derived cells. Circ Res. 108, 813-823 (2011).
