Um método simplificado para Ultra-Baixa Densidade, Long-Term Primária do hipocampo Neuron Cultura

Summary

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Abstract

Cultura de neurônios do hipocampo primárias in vitro facilita interrogatório mecanicista de muitos aspectos do desenvolvimento neuronal. Dissociadas neurónios do hipocampo embrionárias muitas vezes pode crescer com sucesso em lamelas de vidro de alta densidade, sob condições isentas de soro, mas as culturas de baixa densidade, tipicamente requerem um fornecimento de factores tróficos por co-cultivando-as com uma camada alimentadora de células gliais, a preparação dos quais pode ser demorado e trabalhoso. Além disso, a presença de células da glia pode confundir a interpretação dos resultados de estudos e opõe-se sobre os mecanismos específicos de neurónios. Aqui, um método simplificado é apresentado para ultra-baixa densidade (~ 2.000 neurónios / cm ^2), a longo prazo (> 3 meses) cultura de neurónios do hipocampo primário que está sob condições isentas de soro e sem suporte de células da glia. neurónios de baixa densidade são cultivadas em lamelas de poli-revestido D-lisina, e virado em neurónios de alta densidade cultivadas numa placa de 24 poços. Em vez de utilizar pontos de parafina para criar um espaço entrn as duas camadas neuronais, os experimentadores pode simplesmente gravar o fundo de plástico do poço, em que os neurónios de alta densidade reside, para criar um micro-espaço conducente à baixa densidade de crescimento neuronal. A co-cultura pode ser facilmente mantida durante> 3 meses sem perda significativa de neurónios de baixa densidade, facilitando, assim, o estudo morfológico e fisiológico destes neurónios. Para ilustrar esta condição cultura bem sucedida, os dados são fornecidos para mostrar a formação de sinapses profusa em células de baixa densidade após cultura prolongada. Este sistema de co-cultura também facilita a sobrevivência de neurónios individuais esparsos cultivadas em substratos de ilhas de poli-D-lisina e assim a formação de ligações autaptic.

Introduction

Crescer neurónios do hipocampo em condições in vitro permite a observação e manipulação experimental desses neurônios que de outra forma não seriam possíveis in vivo. Esta abordagem experimental é amplamente utilizado para revelar os mecanismos neuronais de crescimento, polaridade, especificação de neurites, tráfico e localização subcelular das proteínas, a formação de sinapses e a maturação funcional ^1. Estes neurónios do hipocampo em cultura in vitro, quando colhido de estágios embrionários tardios, são relativamente pura (> 90%) de células glutamatérgicas morfologia piramidal ^2. Uma vez que os neurónios foram cultivados em uma superfície 2-D sob condições in vitro, este método permite a fácil observação, tais como imagens ao vivo ou imunocitoquímica (ICC) a coloração por meio de um único plano focal ^3; ou manipulações, como o tratamento de droga e transfecções ^3-6. Quando cultivadas em alta densidade, os neurônios tendem a ter altas taxas de sobrevivência por causa de maior concentrations de factores de crescimento segregados em adição ao suporte alimentar a partir do meio de crescimento, e também por causa dos mecanismos dependentes de contacto ⁷ de neurites. No entanto, de baixa densidade neurônios do hipocampo são desejáveis ​​para estudos morfológicos, onde um neurônio individual podem ser visualizados na íntegra ou manchados para análise ICC. Neurônios de baixa densidade são difíceis de manter na cultura devido à falta de apoio parácrina e, portanto, muitas vezes necessitam de suporte trófico de uma camada de alimentação glial (tipicamente cortical astrócitos), que tem de ser preparada antes da neurônio cultura ^2. Quando co-cultivadas com uma camada alimentadora de células gliais, os neurónios de baixa densidade são cultivadas em lamelas, e, em seguida, invertida por cima da camada de células da glia para que os neurónios e glia de baixa densidade estão voltadas uma para a outra. Um pequeno espaço confinado entre as células da glia e os neurónios é criado colocando pontos de parafina sobre as esquinas das lamelas, por conseguinte, a criação de um layout "sanduíche" ^2,8,9. Os neurónios de baixa densidade aumentará Within o espaço confinado entre glia e as lamelas, o que cria um microambiente permissivo com fatores concentrados secretados pelos neurônios e células gliais. Esta abordagem resulta de baixa densidade, os neurônios totalmente desenvolvidos que são espaçados razoavelmente distante, rotulagem ICC, portanto, facilitar ou estudos de imagem ao vivo.

Uma aparente desvantagem de co-cultura neurônio-glia, além de ser demorado e trabalhoso, é que ele impede estudo da específicos de neurónios ou células-autônoma, mecanismos. Embora este sistema é muito menos complexo do que in vivo do tecido neural, impacto glia em neurônio desenvolvimento através secretadas, fatores não-ainda-completamente-definidos podem confundir as experiências ^10. Portanto, em experiências que requerem a investigação dos mecanismos específicos de neurónios, as condições de cultura definidas que remover o soro e a camada de suporte da glia são necessárias. Um estudo anterior teve sucesso na cultura de baixas concentrações de neurónios (~ 9.000 células / cm ²⁾ usando um thmatriz de hidrogel dimensional ree ^11. Uma vez que uma população de neurónios relativamente puro pode ser cultivado a elevada densidade, sob condições isentas de soro, sem apoio da glia, que a hipótese de que ultra-baixa densidade de neurónios do hipocampo pode ser cultivada em meio de cultura isento de soro definido por co-cultura destas com neurónios de alta densidade, em uma forma que é análogo ao processo de co-cultura neurónio-glia convencionalmente adoptada. Com efeito, a alta densidade de hipocampo de culturas de neurónios em uma configuração "sandwich" têm sido recentemente utilizadas para suportar um pequeno número de neurónios magnocelulares endócrinas especializadas ^12.

Portanto, co-cultura com os neurônios de alta densidade podem permitir que os neurônios de baixa densidade para receber fatores suporte trófico que seja suficiente para permitir a sobrevivência a longo prazo. Este protocolo de neurônios ultra-baixa densidade de cultivo foi assim formulado e validado. O protocolo pode ser implementada dentro de uma única experiência, através da preparação de alta densidade (~ 250000 células / ml) de disneurónios do hipocampo sociada em primeiro lugar, e, em seguida, fazer uma diluição para se obter uma densidade de ~ 10.000 neurónios / mL (~ 3.000 neurónios / lamela, ou ~ 2.000 neurónios / ^cm2), que é muito mais baixa do que a maioria relatado culturas de baixa densidade ^{2,3,9 , 11,13.} Esta condição cultura é vagamente referida como cultura "ultra-baixa densidade" e utilizada com "baixa densidade" inter-changeably. Os neurónios de alta densidade são plaqueadas em poli-D-lisina revestidas placas de 24 poços; enquanto que os neurónios de baixa densidade são semeadas em lamelas de vidro de 12 mm revestidas com poli-D-lisina, que são colocados dentro de outra placa de 24 poços. As lamelas com aderindo neurónios de baixa densidade são viradas na parte superior dos neurónios de alta densidade de 2 horas mais tarde, após os neurónios são descidos e ligado às lamelas. Além disso, em vez de utilizar pontos de cera de parafina para elevar as lamelas acima do neurónio da camada de alta densidade, uma agulha de seringa de 18 G foi utilizada para gravar o fundo das placas de 24 poços com duas tiras paralelas. O displ resultanteACED, plásticos adjacentes fornecer um suporte elevado para as lamelas de vidro. Este espaço é constantemente medido a 150-200 mm, o que permite a troca de oxigênio e meio de cultura suficiente, proporcionando um microambiente com fatores tróficos concentradas. Sob esta condição, os neurônios de baixa densidade crescer extensivamente, e pode sobreviver mais de três meses em cultura. Quando esses neurônios são transfectadas com plasmídeo GFP após três semanas em cultura, os dendritos são profusamente ornamentada com espinhas dendríticas. Como prova de princípio, os dados são apresentados para mostrar que este sistema de co-cultura suporta culturas ultra-baixa densidade de neurônios do hipocampo semeadas em poli-D-lisina "micro-ilhas", onde os neurônios formam conexões autaptic que podem facilitar a investigação de células , mecanismos -autonomous de rede independentes.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais envolvendo ratos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade do Arizona, e conformado com as diretrizes do NIH. 1. Tissue Fonte para hipocampo Neuron Cultura Para gerar filhotes de rato pré-natal para hipocampo neurônio cultura, usar camundongos tempo grávidas (C57BL6 / J) que são criados na casa 17. O dia de detecção com rolhão vaginal é designado como E0.5. O tempo de colheita prevista pa…

Representative Results

O protocolo aqui descrito permite bem sucedida de ultra-baixa densidade, a cultura de longo prazo de neurónios glutamatérgicos puros sem a necessidade de células da glia que servem como uma camada alimentadora. O protocolo é diagramado na Figura 1, que envolve a preparação de alta densidade (em poli-D-lisina revestido 24 poços) e de neurónios de baixa densidade (em lamelas de vidro revestidas com poli-D-lisina), em separado, e subsequente co-cultura que pode ser …

Discussion

Apresenta-se um protocolo detalhado para a cultura de longo prazo de ultra-baixa densidade de hipocampo de neurónios glutamatérgicos sob condições isentas de soro. Em ~ 2000 neurônios / cm ^2, a densidade é pelo menos duas vezes menor do que a maioria preparações "baixa densidade" de cultura com ou sem apoio glia relatado pela literatura existente ^{2,3,11,13,14.} Além de ser ultra-baixa densidade, este protocolo é nova e significativa em mais duas formas. Em primeiro lugar, nenhuma…

Materials

Neurobasal medium	Life Technologies	21103-049	Protect from light
B27 supplement	Life Technologies	17504-044	aliquot, store in 0.6ml size
GlutaMAX-I	Life Technologies	35050-061	dilute 100X
antibiotic-antimycotic (AA)	Life Technologies	15240-096	dilute 100X
Complete Culture medium			Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Wash medium			same as 'Neurobasal medium'
Feed medium			Neurobasal with 1X B27 supplement
DNAse I	Sigma-Aldrich	D5025	prepare 100X stock at 0.6mg/ml
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407	M.W. 70000-150000
borate buffer	Sigma-Aldrich	B6768 (boric acid); 71997(borax)	1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl
12-mm round glass coverslips	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply
proFection transfection kit	Promega	E1200	see  protocol for details
2X HEPES buffered saline (HBS)	Promega	E1200	see  protocol for details
Syringe filter	Pall Corporation	4192	0.2um pore size
Endofree plasmid prep kit	Qiagen	12362	for preparation of transfection grade plasmid DNA
anti-MAP2 antibody	Millipore	MAB3418	mouse antibody, clone AP20
anti-p-Tau antibody	Millipore	AB10417	rabbit polyclonal antibody
anti-NR1 antibody	Millipore	MAB1586	mouse antibody, clone R1JHL
anti-GluR1 antibody	Millipore	AB1504	rabbit polyclonal antibody
Hank's balanced salt solution	ThermoFisher	14025092	500ml size