العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي
Summary
Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.
Abstract
البحث Exosome في السنوات الثلاث الماضية وسعت كثيرا من نطاق نحو تحديد وتوصيف المؤشرات الحيوية واستخداماتها العلاجية.
وقد ثبت Exosomes مؤخرا لاحتواء الرنا الميكروية (ميرس). نشأت ميرس أنفسهم المؤشرات الحيوية القيمة لأغراض التشخيص. كما جمع العينات في العيادات والمستشفيات هو متغير تماما، ميرنا بمعزل عن الصفراء كلها تختلف إلى حد كبير. لتحقيق قوية ودقيقة وقابلة للتكرار الشخصية ميرنا من عينات الصفراء التي تم جمعها بطريقة بسيطة يتطلب وضع بروتوكول ذات جودة عالية لعزل وتوصيف exosomes من الصفراء. وتتطلب هذه الطريقة عدة centrifugations وخطوة الترشيح مع خطوة تنبيذ فائق النهائية لتكوير exosomes معزولة. المجهر الإلكتروني، البقع الغربية، وتدفق الخلوي ومتعددة المعلمة جسيمات متناهية الصغر تحليل البصرية، حيثما كان ذلك متاحا، خطوات حاسمة توصيف للتحقق من جودة هxosomes. لعزل ميرنا من هذه exosomes، ارتفاعه المحللة مع ذلك، ميرنا الاصطناعية غير محدد من الأنواع مثل ايليجانس انواع معينة، أي سل-مير-39، من المهم للتطبيع كفاءة استخراج الحمض النووي الريبي. عزل exosome من السائل المراري التالي هذا الأسلوب يسمح للميرنا ناجحة التنميط من عينات الصفراء تخزينها لعدة سنوات في -80 درجة مئوية.
Introduction
مثل غيرها من السوائل البيولوجية، أي حليب الثدي، البلازما أو البول، والصفراء تحتوي exosomes، الدهون الحويصلات الغنية 1-4. يمكن Exosomes حمل أو تغيير الوظائف البيولوجية في خلايا المتلقي 5، 6، شكل من أشكال الاتصال خلية خلية التي قد تكون جزءا من وظيفة وضعها الطبيعي 4، 7-9. يمكن أن تحتوي Exosomes الأنواع ميرنا التي يمكن أن توفر مصدرا قيما للالمؤشرات الحيوية للتشخيص 10. اكتسبت ملامح miRNAs اهتماما كبيرا في السنوات الأخيرة كعلامات التشخيصية والتنبؤية لمجموعة متنوعة من الأمراض 11-14.
ميرنا نفسها يمكن العثور عليها في السوائل البيولوجية، وربما تفرز من الخلايا الميتة وكمية من الخلايا سقيفة يمكن أن تتأثر بشكل كبير من قبل المرض الأساسي. البيانات الشخصية ميرنا من exosomes لا تعبر بالضرورة عن الشخصية ميرنا الخلية تنشأ 6، 10، 15-17، بعد exosomes قد تحمل تواقيع ميرنا التي قد تكون سمة لم الوالدينليرة لبنانية ترغب في الخلايا السرطانية. وقد تم تحديد exosomes المستمدة من ورم في بلازما المرضى الذين يعانون من السرطان الرئوي وسرطان البروستاتا والأورام الأخرى 8 و 16 و 18.
والهدف من هذه الطريقة هو العزلة متينة وموثوق بها من exosomes من العينات الصفراء الإنسان ومستقلة إلى حد كبير من إجراءات التعامل مع فترة سابقة. وقد تم تطويره لاستخدام الصفراء كمصدر موثوق به من ميرنا لتشخيص محتمل للأمراض القناة الصفراوية مثل سرطان القنوات الصفراوية cholangiocarcinoma 19. انها تتكون من عدة خطوات الطرد المركزي مع زيادة سرعات لعزل exosomes وقد تكون قابلة للتطبيق على السوائل البيولوجية الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
للاستفادة موثوق exosomes معزولة عن النكد، فمن المهم استخدام وسائل عالية الجودة بما يتفق العزلة للحصول على عينات عالية الجودة في المقابل. منهجية محددة في هذه الورقة هي وسيلة راسخة لعزل exosomes وميرنا من الصفراء الإنسان. وهو يسلط الضوء على عدد من الخطوات الهامة في توصيف exosomes …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).
Materials
| 0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| cOmplete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
References
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649 (2013).
- Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856 (2014).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282 (2011).
- Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
- Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
- Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
- Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
- Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).
