Isolamento e Caracterização do perfil de exossomas de bílis humana contendo MicroRNA-

Summary

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Abstract

pesquisa exossomo nos últimos três anos tem muito alargou o âmbito para a identificação e caracterização de biomarcadores e seus usos terapêuticos.

Os exossomas foram recentemente mostrado para conter microARNs (miRs). Mirs-se ter surgido como biomarcadores valiosos para fins de diagnóstico. Como a coleta da amostra em clínicas e hospitais é bastante variável, o isolamento miRNA de bile toda varia substancialmente. Para atingir perfis de miARN robustos, precisos e reprodutíveis a partir de amostras biliares recolhidos de uma maneira simples necessário o desenvolvimento de um protocolo de alta qualidade para isolar e caracterizar os exossomas a partir de bílis. O método requer diversas centrifugações e um passo de filtração com um passo final de ultracentrifugação para sedimentar os exossomas isolado. microscopia eletrônica, Western blot, citometria de fluxo e multi-parâmetro de nanopartículas análise óptica, quando disponíveis, são passos de caracterização cruciais para validar a qualidade do exosomes. Para o isolamento de miARN a partir destes exossomas, spiking com o lisado, um miARN sintético não específico de uma espécie, como Caenorhabditis elegans, ou seja, Cel-miR-39, é importante para a normalização da eficácia da extracção do ARN. O isolamento de exossoma a partir do fluido bílis após este método permite que a miARN bem sucedida de perfis a partir de amostras biliares armazenados durante vários anos a -80 ° C.

Introduction

Como outros fluidos biológicos, ou seja, leite materno, plasma ou urina, na bílis contém exossomas, lípidos ricos vesículas ^1-4. Exossomos podem induzir ou alterar funções biológicas em células receptoras ^{5, 6,} uma forma de comunicação célula-célula que pode ser parte da sua função normal ^{4, 7-9.} Exossomos podem conter espécies de miRNA que podem fornecer uma valiosa fonte de biomarcadores para o diagnóstico ^10. perfis miARNs ganharam substancial atenção nos últimos anos como marcadores de diagnóstico e de prognóstico para uma variedade de doenças ^11-14.

si miARN pode ser encontrado em fluidos biológicos, possivelmente libertados por células mortas e a quantidade de células vertente pode ser grandemente influenciado por uma doença subjacente. O perfil de miRNA de exossomos não reflete necessariamente o perfil de miRNA da célula originária ^{6, 10, 15-17,} ainda exossomos podem transportar assinaturas miRNA que pode ser característica da ce parentalll como uma célula tumoral. Exossomas derivado de tumor foram identificados no plasma de doentes com adenocarcinoma do pulmão, cancro da próstata e outros tumores ^{8, 16, 18.}

O objetivo deste método é o isolamento fiável e robusta de exossomos de espécimes biliares humanos, em grande parte independentes dos seus procedimentos de manuseio anteriores. Foi desenvolvido para utilizar biliar como uma fonte segura de miARN potencial para o diagnóstico de doenças do ducto biliar, tais como colangiocarcinoma ^19. É constituída por vários passos de centrifugação com o aumento das velocidades de isolar exossomas e pode ser aplicável a outros fluidos biológicos.

Protocol

A obtenção da bile de pacientes por colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (CPRE) requer a aprovação de um protocolo de estudo seres humanos pela Institutional Review Board. Todo o trabalho aqui apresentado foi aprovado pela Johns Hopkins University Institutional Review Board. 1. exossomo Isolamento da Bile Execute colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (CPRE). Colocar o paciente em decúbito dorsal e entubar. Passar um duodenoscópio através da b…

Representative Results

Desde exossomas são demasiado pequenos para serem detectados por microscopia regular ou citometria de fluxo, microscopia de electrão ou óptica nanopartículas tem de ser realizada. A análise óptica de nanopartículas tem a vantagem sobre a microscopia de electrões que é também quantitativa e proporciona uma distribuição de tamanho e concentração. O aparelho apresenta um feixe de laser focado finamente através de um prisma de vidro para a amostra. O movimento browniano das ve…

Discussion

Para utilizar de forma confiável exosomes isoladas de bile, é importante empregar métodos de alta qualidade consistente de isolamento para obter amostras de alta qualidade em troca. A metodologia definida neste trabalho é uma forma bem estabelecida para isolar exossomos e miRNA de bílis humana. Ele destaca várias etapas cruciais na caracterização dos exossomos isolados, que no mínimo deve incluir microscopia eletrônica ou óptica de nanopartículas e Western blot.

O passo mais impo…

Materials

0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter	Corning	431229
thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331374
SW40Ti rotor	Beckman Coulter
LM10-HS	Nanosight
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software	Nanosight
mirVANA	Life Technologies	AM1560
cOmplete Protease Inhibitor	Roche distributed by Sigma-Aldrich	4693116001
Immobilon PSQ	Millipore, Bedford MA	ISEQ00010
Anti-CD63 antibody	Abcam	ab59479
Anti-Tsg101	Abcam	ab30871