تعزيز 3-D تجميع الخلايا FACS تنقية التوتة طلائي مع EAK 16-II / EAKIIH6 الذاتي تجميع هيدروجيل
Summary
This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.
Abstract
Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.
Introduction
الغدة الصعترية هي الجهاز الليمفاوي الرئيسية المسؤولة عن توليد مجموعة متنوعة من السكان من الخلايا T-متسامح الذاتي الممرض رد الفعل التي لا غنى عنها لوظيفة نظام المناعة المكتسبة. وإنما هي جهاز ديناميكي حيث thymocytes النامية، هاجر من نخاع العظام والخلايا اللمفاوية السلف، الهجرة من خلال ثلاثي الأبعاد (3-D) مصفوفة تشبه الاسفنج للسدى الغدة الصعترية، والخضوع النسب المطابقة للمواصفات والتمايز، والهجرة في نهاية المطاف كما ناضجة الخلايا التائية. نجاح هذه العملية مبرمجة بشكل جيد يعتمد إلى حد كبير على الحديث المتبادل بين وthymocytes المهاجرة والخلايا الظهارية السكنية الغدة الصعترية (TECS)، فإن عدد سكان السائد للسدى الغدة الصعترية التي هي ضرورية لإنشاء والحفاظ على سلامة المكروية الغدة الصعترية.
واستنادا إلى موقعها التشريحي وظيفة فريدة من نوعها، TECS يمكن تقسيمها إلى مجموعتين فرعيتين: وTECS في القشرة (cTECs) التي هي responsible لاختيار-MHC النفس (كبير مجمع التوافق النسيجي) يقتصر خلايا تي (اختيار إيجابية)، وTECS في النخاع (mTECs) التي هي ضرورية للقضاء على autoreactive خلايا تي (اختيار السلبية) 1،2. العديد من العوامل (على سبيل المثال، والشيخوخة، والعدوى، أشعة، علاج المخدرات) يمكن أن يسبب الأضرار التي لا رجعة فيها لظهارة الغدة الصعترية، مما أدى إلى حصانة التكيفية للخطر. وعلى الرغم من المحاولات العديدة، لم استعادة وظيفة الغدة الصعترية صعبة نظرا لصعوبة إعادة إنشاء المكروية الغدة الصعترية. والجدير بالذكر أن الغدة الصعترية ثلاثي الأبعاد (3-D) التكوين أمر بالغ الأهمية لبقاء وظيفة TECS، في حين TECS مثقف في بيئة 2-D تقلل بسرعة التعبير عن الجينات الهامة لthymopoiesis 3،4.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) و C-محطة نظائره histidinylated EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) ومنخفضة الوزن الجزيئي، oligopeptides محبة للجهتين القابلة للذوبان في توفير المياه منزوع الأيوناتص، ولكن الخضوع دبق من تشكيل الألياف بيتا عندما تتعرض لقوة الأيونية أعلى من 20 ملي كلوريد الصوديوم (ملح الطعام العادي تركيز في السوائل في الجسم البشري هو 154 ملم). هذا العقار استجابة البيئية يجعلها اللبنات تنوعا لتشكيل هياكل 3D. وصاحب العلامة على EAKII-H6 توفر آلية لرسو السفن، التي معاداة صاحب الجماعات الحكومية الدولية / FC-ملزمة المؤتلف بروتين A / G (αH6: السلطة الفلسطينية / G) يمكن المجمعات بمثابة محول لترسيخ المخدرات البروتين والجزيئات الحيوية الأخرى ( على سبيل المثال، والأجسام المضادة) على مركب هيدروجيل 5-8.
لقد أثبتنا سابقا أن جزيئات مفتش الفلورسنت المسمى ترسو على هيدروجيل يمكن الاحتفاظ بها في مكان الحقن لمدة تصل إلى 13 أيام 9. وعلاوة على ذلك، عندما αH6: تم إضافة محولات السلطة الفلسطينية / G الراسية مع مكافحة CD4 الجماعات الحكومية الدولية هيدروجيل EAK16-II / EAKIIH6 (EAK)، تم القبض على خلايا CD4 + T تحديدا 10. باستخدام تقنية مشابهة، لقد أثبتنا مؤخرا أن 3-D تجميع TECS جولد تعزيزه في EAK هيدروجيل مع المجمعات محول تحمل-TEC محدد أضداد EpCAM (αH6: السلطة الفلسطينية / G: αEpCAM). عندما زرعها تحت كبسولات الكلى من الفئران عارية، ويمكن للمجموعات TEC جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل EAK تدعم بشكل فعال في تطوير خلايا T وظيفية في الجسم الحي 11،12.
نحن هنا توضيح لدينا وسيلة لتنقية بسرعة وفعالية TECS مع الفرز مضان تنشيط الخلايا (FACS) وتوليد 3-D المجاميع TEC مع نظام EAK هيدروجيل.
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين TECS هي السكان السائد للسدى الغدة الصعترية وتلعب أدوارا أساسية للهيكل وظيفة من وظائف الغدد الغدة الصعترية، أنهم لا يمثلون سوى حوالي 0.1-0.5٪ من إجمالي الخلوية الغدة الصعترية. بل هي أيضا الخلايا الهشة كما هي لاحظت ارتفاع نسبة موت الخلايا في بعض الأحيان بعد الهضم كول…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح R21 AI113000 (ساموا) وR01 AI123392 (YF).
Materials
| 1. TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1X PBS, 0.1% BSA, 2mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 mL RPMI-1640, 0.025 mg/mL Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/mL DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2cc U-100 Insulin syringe 28G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5mL Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100um Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Cell sorting | |||
| 5mL Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2uL per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10uL per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10uL per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. EAK gel assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5mL Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5mL microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10mg/mL | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5mg/mL | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5mM HEPES, 50uM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100X) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
