Het bevorderen van 3-D Aggregation van FACS Gezuiverd thymus epitheelcellen met EAK 16-II / EAKIIH6 Self-assembleren Hydrogel
Summary
This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.
Abstract
Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.
Introduction
De thymus is de belangrijkste lymfoïde orgaan verantwoordelijk voor het genereren van een gediversificeerde populatie van pathogeen-reactieve, zelfverdraagzaam T-cellen die essentieel is voor de functie van het verworven immuunsysteem. Het is een dynamisch orgaan waarin ontwikkelingslanden thymocyten immigreerden uit het beenmerg als lymfocyten progenitorcellen, migreren door het sponsachtig driedimensionale (3-D) matrix van de thymus stroma ondergaan lijn-specificatie en differentiatie, en uiteindelijk emigratie als rijpe T-cellen. Het succes van deze goed geprogrammeerde proces hangt grotendeels af van de overspraak tussen de migrerende thymocyten en de residentiële thymus epitheelcellen (TEC), de overheersende bevolking van de thymus stroma die essentieel zijn voor het opzetten en onderhouden van de integriteit van de thymus micromilieu zijn.
Op basis van hun anatomische locatie en unieke functie, kan TEC worden verdeeld in twee subgroepen: de TEC in de cortex (cTECs) die verantwoorde-woordelijk voor het selecteren eigen MHC (major histocompatibility complex) beperkte T-cellen (positieve selectie), en de TEC in de medulla (mTECs) die essentieel zijn voor het elimineren van autoreactieve T-cellen (negatieve selectie) 1,2 zijn. Vele factoren (bijvoorbeeld, veroudering, infectie, bestraling, behandeling met geneesmiddelen) kan onomkeerbare schade veroorzaken aan de thymus epitheel, wat resulteert in een verminderde adaptieve immuniteit. Ondanks talrijke pogingen, herstel van de thymus functie uitdagend omdat het moeilijk om de thymus micro reproduceren. Met name thymus driedimensionale (3-D) configuratie is kritisch voor de overleving en functie van TEC, terwijl TEC gekweekt in een 2-D omgeving snel de expressie van genen essentieel voor thymopoiesis 3,4 te verlagen.
EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) en de C-terminale histidinylated analoge EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) zijn laagmoleculaire amfifiele oligopeptiden die oplosbaar zijn in gedeïoniseerd water, maar ondergaan gelering β-fibrillen bij blootstelling aan ionsterkte lager dan 20 mM NaCl (normale zoutconcentratie in menselijk lichaamsvloeistof 154 mM). Deze reagerende eigenschap milieu maakt ze veelzijdig bouwstenen om 3D-structuren te vormen. Het His-tag on EAKII-H6 heeft een docking mechanisme, waarbij de anti-His IgG / Fc-bindend recombinant eiwit A / G (αH6: pA / G) complexen kunnen als een adapter om eiwit drugs en andere biomoleculen te verankeren te dienen ( bijvoorbeeld antilichamen) aan de hydrogel composiet 5-8.
We hebben eerder aangetoond dat fluorescent-gelabelde IgG-moleculen verankerd op de hydrogel op de injectieplaats gedurende maximaal 13 dagen 9 kan worden gehandhaafd. Wanneer verder de αH6: pA / G adapters verankerd met anti-CD4 IgG's werden toegevoegd aan de EAK16-II / EAKIIH6 (EAK) hydrogel, CD4 + T-cellen werden specifiek vastgelegd 10. Met vergelijkbare techniek, hebben we onlangs aangetoond dat 3-D aggregatie van TEC could worden bevorderd EAK hydrogel met adapter complexen dragen TEC-specifieke anti-EpCAM antilichamen (αH6: pA / G: αEpCAM). Wanneer getransplanteerde nier onder de capsules van naakt muizen, kan de TEC clusters ingebed in EAK hydrogel effectief te ondersteunen de ontwikkeling van functionele T-cellen in vivo 11,12.
Hier illustreren we onze methode om snel en effectief te zuiveren TEC's met fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en het genereren van 3-D-TEC aggregaten met het EAK hydrogel systeem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terwijl TEC de overheersende populatie van de thymus stroma en spelen een essentiële rol voor de structuur en functie van de thymus, zij slechts ongeveer 0,1-0,5% van de totale thymus cellulariteit. Ze zijn ook kwetsbaar cellen zo hoog percentage celdood worden soms waargenomen na digereren door collagenase, dat wil zeggen, de behandeling TEC van de extracellulaire matrix (ECM) dissociëren. Hun zeldzaamheid (~ 200.000 per muis thymus) en kwetsbaarheid maakte het een uitdagende taak om TEC te isoleren. De rece…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund in het kader van de National Institutes of Health subsidies R21 AI113000 (WSM) en R01 AI123392 (YF).
Materials
| 1. TEC Isolation | |||
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2701(1 Gallon) | Ethanol 200 Proof, deionized water |
| Dissecting scissors, straight | Fine Science Tools, Inc. | 91460-11 | |
| Graefe forceps, straight | Fine Science Tools, Inc. | 11053-10 | |
| Graefe forceps, curved | Fine Science Tools, Inc. | 11052-10 | |
| Washing solution | 1X PBS, 0.1% BSA, 2mM EDTA | ||
| 1x PBS (Phosphate buffered saline) | Gibco | 10010-023 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma | A1470-100G | |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | Invitrogen | 15575-038 | |
| Digestion solution | 9 mL RPMI-1640, 0.025 mg/mL Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/mL DNaseI | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05 401 127 001 | referred as "purified collagenase" |
| 1M HEPES | Lonza | 17-737E | |
| Dnase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| 50mL Centrifuge tube | Corning | 430290 | |
| 60mm tissue culture dish | Falcon | 353002 | |
| 1/2cc U-100 Insulin syringe 28G1/2 | Becton Dickinson | 329461 | |
| 5mL Polystyrene round-bottom tube | Falcon | 352058 | |
| 5ml glass pipet | Fisher Healthcare | 13-678-27E | Use for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets. |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi | 130-090-753 | |
| 100um Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Density gradient medium: OptiPrep | Axis-Shield | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. Cell sorting | |||
| 5mL Polypropylene round-bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block) | BD Biosciences | 553142 | Use as undiluted, 2uL per sample |
| Anti-mouse CD45-PercpCy5.5 | eBioscience | 45-0451-80 | Use at 1:150, 10uL per sample |
| Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE | eBioscience | 12-5791-82 | Use at 1:100, 10uL per sample |
| BD Influx | BD Biosciences | ||
| Single cell analysis software | FlowJo | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2. EAK gel assembly | |||
| Anti-His-Tag | AnaSpec | 29673 | "anti-His-Tag IgG" |
| Purified anti-mouse CD326 (EpCAM) | BioLegend | 118202 | "anti-EpCAM IgG" |
| Recombinant protein A/G | Pierce Biotechnology | ||
| 1.5mL Safe-Lock Tubes, Biopur, Sterile | Fisher Healthcare | 05-402-24B | referred as "1.5mL microcentrifuge tube" |
| 96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lid | BD Falcon | 353917 | |
| Rocking platform: Nutator Mixer no.1105 | BD Clay Adams | ||
| 10% sucrose | Sigma | S0389 | Prepare with sterile distilled water |
| EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 10mg/mL | |
| EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2) | American Peptide Company | custom synthesized, 7.5mg/mL | |
| Complete medium | RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5mM HEPES, 50uM 2-Mercaptoethanol | ||
| RPMI-1640 | Gibco | 11879-020 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Atlanta Biologicals | S11150 | Heat inactivated before use |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine 200mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| NEAA (non-essential amino acid) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| 1M HEPES | BioWhittaker | 17-737E | |
| 2-Mercaptoethanol (100X) | Millipore | ES-007-E | |
| Platform shaker: The Belly Dancer | Stovall Life Sciences Inc. | model: USBDbo |
References
- Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
- Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
- Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
- Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
- Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
- Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
- Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
- Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
- Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
- Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
- Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
- Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780 (2014).
- Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
- Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
- Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
- St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860 (2013).
