Covalent liaison des anticorps à la cellulose de papier disques et leurs applications dans l'œil nu colorimétriques immunoessais

Summary

In this manuscript, periodate oxidation and glutaraldehyde cross-linking methods for covalent immobilization of antibodies on paper discs are presented. The binding activity of immobilized antibodies was evaluated. Based on these results, a glutaraldehyde cross-linking method was used to develop a novel paper-based immunoassay for immunoglobulin G (IgG) detection.

Abstract

Ce rapport présente deux méthodes pour l'immobilisation covalente des anticorps de capture sur le filtre de cellulose de qualité de papier n ° 1 (papier filtre à moyen débit) disques et de grade n ° 113 (papier filtre à écoulement rapide) disques. Ces disques de papier de cellulose ont été greffées avec des groupes fonctionnels amine par l'intermédiaire d'une technique de couplage du type silane avant que les anticorps sont immobilisés sur eux. les méthodes de reticulation glutaraldéhyde oxydation et de periodate ont été utilisés pour greffer les anticorps de capture sur les disques de papier de cellulose. Afin de garantir la capacité maximale de liaison des anticorps de capture à leurs cibles après l'immobilisation, les effets de diverses concentrations de périodate de sodium, le glutaraldéhyde, et des anticorps de capture sur la surface des disques de papier ont été étudiés. Les anticorps qui ont été revêtus sur des disques de papier cellulosique à fonction amine par un agent de réticulation glutaraldéhyde ont montré une activité accrue de liaison à la cible par rapport au procédé d'oxydation du periodate. IgG (dans le sérum de référence de la souris) a été utilisé comme une cible de référence dans cette étude pour tester l'application des anticorps immobilisés de manière covalente par le glutaraldéhyde. Un nouveau papier, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) a été développé et validé avec succès pour la détection des IgG. Cette méthode ne nécessite pas d'équipements, et il peut détecter 100 ng / ml d'IgG. Le papier filtre à écoulement rapide était plus sensible que le papier filtre à moyen débit. La période d'incubation de ce test était courte et nécessaire de petits volumes d'échantillons. Cet oeil nu, immuno-essai colorimétrique peut être étendu pour détecter d'autres cibles qui sont identifiés par la méthode ELISA classique.

Introduction

L'étude des tests de point de soins (POCT) de diagnostic est important pour le développement de nouvelles stratégies pour la thérapeutique, la médecine personnalisée, et soins à domicile ^1. Papiers de cellulose sont largement utilisés comme plates – formes dans les immunoessais, car ils ne coûtent pas cher, accessible et familier aux utilisateurs ^2. En outre, la structure poreuse du papier cellulosique possède la puissance pour entraîner l'écoulement du liquide sans impact énergétique supplémentaire. Actes de la bioanalyse sur papier peuvent être trouvés dès le 20 ^e siècle, quand la chromatographie sur papier a été inventé en 1952. L'exemple le plus répandu est des tests immunochromatographiques ^3, tels que la grossesse et de test du diabète bandes. Ces tests fournissent des temps d'analyse relativement rapide et peu coûteuse analyse ^4. En raison de leur simplicité, ces tests de bandes de papier classiques ont été largement utilisés dans le diagnostic ADBD ^5.

Les méthodes de détection , y compris colorimétriques ^6, électrochimiques ⁷ et ⁸ électrochimiluminescence méthodes ont été rapportées pour mesurer des cibles dans des échantillons biologiques. En plus de ces méthodes quantitatives, une méthode fiable pour immobiliser des anticorps sur du papier de cellulose est également importante pour le développement de dispositifs de diagnostic. Adsorption non spécifique est la principale stratégie pour la modification des anticorps sur la surface des dispositifs à base de papier ^{9, 10} pour garantir une capacité de liaison maximale à leurs cibles après l' immobilisation. Cependant, une étude précédente ont montré que les anticorps qui sont adsorbés sur du papier de cellulose peuvent désorber des fibres ¹¹ de 40%. Ainsi, l' adsorption directe d'anticorps sur la cellulose ne peut pas fournir des résultats reproductibles ^12. Covalent immobilisation des anticorps qui sont greffés sur les surfaces de papier est une méthode alternative de développement bioessais sur papier efficaces ^13. Divers procédés ont été rapportés pour la modification de la cellulose ^{14, 15} </sup>. Idéalement, les anticorps doivent maintenir leur fonctionnalité initiale après immobilisation ^12. Carbonyldiimidazole combiné avec du 1-cyano-4-diméthylaminopyridinium tétrafluoroborate ^16; 1-fluoro-2-nitro-4-azidobenzene grâce à une stratégie d'activation à base d'UV ^{17, 18;} une stratégie chimioenzymatique basé sur ¹⁹ modification xyloglucane; un 1,4-phenylenediisothiocyanate agent de liaison ^20; hétéropolysaccharide oxydation ²¹ click chemistry ^22; et ²³ porphyrines cationiques ont été utilisés pour immobiliser de manière covalente de biomolécules sur du papier de cellulose. Chitosan papier modifié a été utilisé pour développer immunodevices à base de papier ^24-26 car elle est abondante et biocompatible ^27. Le chitosane est cationique et adhère fortement à la cellulose anionique ^27. Les anticorps de capture sont immobilisés sur le papier par revêtement de chitosane et de reticulation par le glutaraldéhyde. oxydation periodate est un autre procédé de greffage de la captanticorps ure sur le papier de cellulose ^28. Dans ce procédé, le periodate de sodium est repéré sur le papier pour convertir le 1,2-dihydroxylé (glycol), les groupes de cellulose directement à des groupes aldéhyde. Les groupes aldéhyde sont ensuite utilisés pour former des liaisons covalentes entre les polysaccharides et les anticorps ^28. Bien que la fabrication est simple, il est difficile de se laver complètement periodate de sodium. Le periodate de sodium non lavé peut provoquer une oxydation supplémentaire des anticorps qui sont immobilisés sur le papier de cellulose, ce qui affecte l'activité et la stabilité des anticorps N -. (3-diméthylaminopropyl) – N chlorhydrate -ethylcarbodiimide et N linkers croisées hydroxysuccinimide sont également utilisés pour immobiliser de façon covalente à des anticorps électrofilage d' acide et d' acétate de cellulose , des nanofibres de poly-l-lactique pour le développement de dosages à base de ^{nanofibres-29.}

Dans cette étude, une technique de couplage de type silane a été utilisé pour greffer des groupes fonctionnels amine sur cellulose des disques de papier. Cette technique permet de conserver la taille d'origine des pores, mèche, et le taux des papiers filtres de cellulose de filtration, ce qui permet un maximum vertical immunoessais accréditives dans. La technique de couplage à base de silane a été largement utilisé dans des biocapteurs pour fonctionnaliser des surfaces de substrats avec des groupes amine secondaire, suivie d'une modification supplémentaire à l'aide de biomolécules. Le greffage de groupes amine sur la surface de la matrice comprend une réaction de condensation entre des groupes -OH des agents de silane organofonctionnel et d'une matrice ³⁰ substrat. Les disques de papier de cellulose ont été fonctionnalisés par des groupes amine par couplage à base de silane par le 3-aminopropyltriméthoxysilane (APS) ^31. Ceci a été suivi par l'anticorps de capture de manière covalente immobilisant à l'aide de deux méthodes différentes. Le premier procédé implique la liaison des anticorps de capture oxydé au periodate des disques de papier de cellulose à fonctionnalité amine. La deuxième méthode utilise le glutaraldéhyde comme agent de reticulation pour fixer la capture Antibodies aux disques de papier de cellulose fonctionnalisée groupe-amine. La présence d'anticorps de capture a été confirmée par une IgG de lapin isothiocyanate de fluorescéine anti-humain (FITC), en utilisant un système d'imagerie moléculaire par fluorescence. L'activité de liaison des anticorps de lapin anti-IgG humaine-FITC de chèvre à l'IgG anti-lapin a également été évaluée par le substrat de la peroxydase. Les effets de diverses concentrations de périodate de sodium, le glutaraldéhyde, et des anticorps de capture ont été étudiés. Le test de l'anticorps de capture immobilisé d'application a été réalisée avec succès grâce à la détection de sérum IgG.

Protocol

1. Intensification groupes fonctionnels amine sur cellulose de papier Disques Préparer un morceau de papier carré avec une dimension de 1 cm x 1 cm, et 100 disques de papier fabriqués à partir de la catégorie no 1 papier de cellulose avec un diamètre de 6,0 mm (papier filtre à moyen débit) à l'aide d'un poinçon. Pour tirer -NH 2 groupes sur les disques de papier, mélanger 1 ml APS et 10 ml d' acétone dans un flacon en verre de 50 ml dans la hotte. Ajouter des disqu…

Representative Results

Transformer Figure 3. Fourier infrarouge (FTIR) de papier filtre à moyen débit non traité et APS-traité carré (A) et le filtre à écoulement rapide papier carré (B). A. Les spectres pour le filtre à moyen écoulement brut papier carré était similaire à celle de l'APS filtre à moyen débit traité papi…

Discussion

le revêtement direct de chèvre purifié par affinité anti-Souris IgG-Fc de l'anticorps de capture sur des disques de papier de cellulose non modifié a été réalisée pour détecter les concentrations d'IgG. Les résultats indiquent que, outre la fixation des anticorps de capture est nécessaire pour la reproductibilité. La technique de silane a été utilisé avec succès pour introduire des groupes fonctionnels amine sur les disques de papier de cellulose ^34. La concentration de l'APS affe…

Materials

Cellulose filter paper, Grade1 (medium flow filter paper)	GE Healthcare Pte Ltd Singapore	1001 110
Cellulose filter paper, Grade113 (Fast flow filter paper)	Sigma-Aldrich, Singapore	1113-320
3-​Aminopropyl​trimethoxysilane	Sigma-Aldrich, Singapore	T1255	>96%
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich, Singapore	G6257	Grade II, 25% in H2O
Surfactant	Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore	P2287
Bovine serum album	Sigma-Aldrich, Singapore	A2153
Skimmed milk powder	Louis François		Packed by Kitchen Capers, Singapore
Tris base	Promega	H5135
Sodium periodate	Merck	106597
Na2HPO4	Merck	106585
KH2PO4	Merck	104873
NaCl	CALBIOCHEM	567441
NaOH	Merck	106462
HCL	Merck	100317
phosphate buffer saline (PBS)	N/A	N/A	PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl
Acetone	Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore	9005-68
Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution	1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce	34029	1 L
Rabbit anti-human IgG-FITC	TWC/Bio Pte Ltd Singapore	sc-2278
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG	TWC/Bio Pte Ltd Singapore	sc-2030
Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody	Bethyl Laboratories, Inc	A90-131A
Mouse reference serum	Bethyl Laboratories, Inc	RS10-101-5	9.5 mg/mL
HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody	Bethyl Laboratories, Inc	A90-131P
Equipment
Fourier transform infrared spectrophotometer	Shimadzu IR Prestige-21	N/A
Fluorescence molecular imager	Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore	N/A
Oven	NUVE FN500	N/A
Turbo mixer VM-2000	MYC LTD	N/A
Image J	RGB, free download	N/A