Covalente La unión de anticuerpos a los discos de papel de celulosa y sus aplicaciones en-simple vista colorimétricos inmunoensayos
Summary
In this manuscript, periodate oxidation and glutaraldehyde cross-linking methods for covalent immobilization of antibodies on paper discs are presented. The binding activity of immobilized antibodies was evaluated. Based on these results, a glutaraldehyde cross-linking method was used to develop a novel paper-based immunoassay for immunoglobulin G (IgG) detection.
Abstract
Este informe presenta dos métodos para la inmovilización covalente de anticuerpos de captura en papel de filtro de celulosa de grado N ° 1 (papel de filtro de flujo medio) y discos de grado Nº 113 (papel de filtro de flujo rápido) discos. Estos discos de papel de celulosa fueron injertados con grupos funcionales de amina a través de una técnica de acoplamiento de silano antes de que los anticuerpos se inmovilizan sobre ellos. métodos de reticulación periodato de oxidación y glutaraldehído fueron utilizados para injertar anticuerpos de captura en los discos de papel de celulosa. A fin de garantizar la capacidad de unión máxima de los anticuerpos de captura a sus objetivos después de la inmovilización, se investigaron los efectos de diversas concentraciones de peryodato de sodio, glutaraldehído, y anticuerpos de captura en la superficie de los discos de papel. Los anticuerpos que se recubrieron sobre los discos de papel de celulosa funcionalizada con amina a través de un agente de entrecruzamiento con glutaraldehído mostraron una mayor actividad de unión a la diana en comparación con el método de oxidación con peryodato. IgG (en suero de referencia de ratón) se utilizó como un objetivo de referencia en este estudio para probar la aplicación de anticuerpos inmovilizados covalentemente a través de glutaraldehído. Un nuevo, ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas basado en papel (ELISA) se desarrolló con éxito y validada para la detección de IgG. Este método no requiere un equipo, y puede detectar 100 ng / ml de IgG. El papel de filtro de flujo rápido era más sensible que el papel de filtro de flujo medio. El período de incubación de este ensayo fue corta y requiere volúmenes de muestra pequeños. Este simple vista, inmunoensayo colorimétrico puede extenderse para detectar otros objetivos que se identifican con ELISA convencional.
Introduction
El estudio de diagnóstico de la prueba de punto de atención (POCT) es importante para el desarrollo de nuevas estrategias para la terapéutica, la medicina personalizada y la atención domiciliaria 1. Papeles de celulosa son ampliamente utilizados como plataformas en inmunoensayos, ya que son baratos, accesible y familiar para los usuarios 2. Además, la estructura porosa del papel de celulosa posee la potencia para impulsar el flujo de líquido sin impacto adicional de energía. Los registros de bioanálisis en papel se pueden encontrar ya en el siglo 20, cuando la cromatografía en papel fue inventado por primera vez en 1952. El ejemplo más frecuente es pruebas de inmunocromatografía 3, tales como tiras de prueba de embarazo y la diabetes. Estas pruebas proporcionan tiempos de ensayo relativamente rápido y barato análisis 4. Debido a su simplicidad, estas pruebas tira de papel convencionales se han usado ampliamente en el diagnóstico POCT 5.
Los métodos de detección colorimétrica incluyendo 6, electroSe han reportado químicos 7, y 8 de electroquimioluminiscencia métodos para medir los objetivos en muestras biológicas. Además de estos métodos cuantitativos, un método fiable para la inmovilización de anticuerpos sobre papel de celulosa también es importante para el desarrollo de dispositivos de diagnóstico. La adsorción no específica es la principal estrategia para la modificación de anticuerpos en la superficie de los dispositivos basados en papel 9, 10 para asegurar la capacidad de unión máxima a sus objetivos después de la inmovilización. Sin embargo, un estudio previo mostraron que los anticuerpos que se adsorben sobre papel de celulosa pueden desorber de las fibras 11 en un 40%. Por lo tanto, la adsorción directa de anticuerpos en celulosa no puede proporcionar resultados reproducibles 12. La inmovilización covalente de anticuerpos que se injertan en las superficies de papel es un método alternativo de desarrollo de bioensayos eficaces basados en papel 13. Varios métodos han sido reportados para la modificación de celulosa 14, 15 </sup>. Idealmente, los anticuerpos deben mantener su funcionalidad original después de la inmovilización 12. Carbonildiimidazol combina con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio 16; 1-fluoro-2-nitro-4-azidobenzene a través de una estrategia de activación a base de UV 17, 18; chemoenzymatic una estrategia basada en la modificación xiloglucano 19; un agente de enlace 1,4-phenylenediisothiocyanate 20; heteropolisacárido oxidación química clic 21 22; y porfirinas catiónicas 23 se han utilizado para inmovilizar covalentemente biomoléculas sobre papel de celulosa. Papel modificado Chitosan se ha utilizado para desarrollar immunodevices en papel 24-26 ya que es abundante y biocompatible 27. El quitosano es catiónico y se adhiere fuertemente a celulosa aniónico 27. Los anticuerpos de captura se inmovilizan sobre el papel a través de revestimiento de quitosano y entrecruzamiento con glutaraldehído. La oxidación del peryodato es otro método para injertar la captanticuerpos ure en el papel de celulosa 28. En este método, peryodato de sodio es descubierto en el papel para convertir grupos 1,2-dihidroxilado (glicol) en celulosa directamente a grupos aldehído. Los grupos aldehído se utilizan entonces para formar enlaces covalentes entre polisacáridos y anticuerpos 28. Aunque la fabricación es simple, es difícil de lavar completamente fuera de peryodato de sodio. El peryodato sódico sin lavar puede causar oxidación adicional de los anticuerpos que están inmovilizados sobre el papel de celulosa, que afectan a la actividad y la estabilidad de los anticuerpos N -. (3-dimetilaminopropil) – N hidrocloruro de etilcarbodiimida y N hidroxisuccinimida reticulantes también se utilizan para covalentemente inmovilizar anticuerpos en ácido y de acetato de celulosa nanofibras de poli-L-láctico electrospun para el desarrollo de ensayos basados en nanofibras 29.
En este estudio, se utilizó una técnica de acoplamiento de silano para injertar grupos funcionales de amina en cellulosdiscos de papel e. Esta técnica ayuda a retener el tamaño original de poros, efecto de mecha, y la tasa de filtración de los papeles de filtro de celulosa, lo que permite un máximo de inmunoensayos de flujo continuo en verticales. La técnica de acoplamiento de silano ha sido ampliamente utilizado en los biosensores para funcionalizar superficies de sustrato con grupos amina secundaria, seguido de la modificación adicional utilizando biomoléculas. El injerto de grupos amina en la superficie de la matriz comprende una reacción de condensación entre grupos -OH de los agentes de silano organofuncional y el sustrato de la matriz 30. Los discos de papel de celulosa fueron funcionalizados con grupos amino de acoplamiento de silano a través de 3-aminopropiltrimetoxisilano (APS) 31. Esto fue seguido por anticuerpos de captura covalentemente inmovilización utilizando dos métodos diferentes. El primer método implicó la unión de anticuerpos de captura oxidados con peryodato de los discos de papel de celulosa de amina funcionalizado. El segundo método usa glutaraldehído como agente de reticulación para unir el Antibodi capturaES para los discos de papel de celulosa funcionalizado grupos amina. La presencia de anticuerpos de captura fue confirmada por conejo isotiocianato de fluoresceína IgG-anti-humano (FITC), utilizando un generador de imágenes de fluorescencia molecular. La actividad de unión de conejo anti-humano IgG-FITC de IgG de cabra anti-conejo también fue evaluada por sustrato de peroxidasa. Se investigaron los efectos de diversas concentraciones de peryodato de sodio, glutaraldehído, y anticuerpos de captura. La prueba de la aplicación del anticuerpo de captura inmovilizado se realizó con éxito a través de la detección de suero IgG.
Protocol
Representative Results
Discussion
El recubrimiento directo de afinidad purificada de cabra anti-ratón de anticuerpo de captura IgG-Fc sobre discos de papel de celulosa no modificada se realizó para detectar concentraciones de IgG. Los resultados indicaron que, se requiere más la fijación de los anticuerpos de captura para la reproducibilidad. La técnica de silano fue utilizado con éxito para introducir grupos funcionales de amina a los discos de papel de celulosa 34. La concentración de APS afecta a la inmovilización de anticuerpos. P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financially supported by the Ministry of Education, Singapore through the Translational and Innovation Grant (MOE2012-TIF-2-G-009).
Materials
| Cellulose filter paper, Grade1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich, Singapore | T1255 | >96% |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCL | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/mL |
| HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| Image J | RGB, free download | N/A | |
References
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