Citología de Impresión del Área de limpiaparabrisas tapa
Summary
We collected, stained and imaged cells from the conjunctiva of the inner eyelid margin of human subjects. By characterizing cell morphology and metabolic activity, this method may further our understanding of dry eye and the role that friction between the ocular surfaces may play in perceiving ocular discomfort.
Abstract
Few reports on the cellular anatomy of the lid wiper (LW) area of the inner eyelid exist and only one report makes use of cytological methods. The optimization of a method of collecting, staining and imaging cells from the LW region using impression cytology (IC) is described in this study. Cells are collected from the inner surface of the upper eyelid of human subjects using hydrophilic polytetrafluoroethylene (PTFE) membranes, and stained with cytological dyes to reveal the presence of goblet cells, mucins, cell nuclei and various degrees of pre- and para-keratinization. Immunocytochemical dyes show cell esterase activity and compromised cell membranes by the use of a confocal scanning laser microscope. Up to 100 microscopic digital images are captured for each sample and stitched into a high-resolution, large scale image of the entire IC span. We demonstrate a higher sensitivity of IC than reported before, appropriate for identifying cellular morphologies and metabolic activity in the LW area. To our knowledge, this is the first time this selection of fluorescent dyes was used to image LW IC membranes. This protocol will be effective in future studies to reveal undocumented details of the LW area, such as assessing cellular particularities of contact lens wearers or patients with dry eye or lid wiper epitheliopathy.
Introduction
El párpado superior humano ejecuta alrededor de 10.000 parpadea cada día 1, con sólo un 1 – 2 mm región conjuntival estrecha opuestos del globo ocular. Debido a su movimiento de limpieza durante el parpadeo, esta porción de la margen del párpado se ha denominado la región "tapa de limpiaparabrisas" 2. Se supone que la fricción se incrementa en esta región durante el parpadeo habitual, debido a la tapa limpia el mundo. Esto puede jugar un papel importante en la comodidad ocular. Los portadores de lentes de contacto, en particular, la experiencia malestar ocular y esta es una de las principales razones para cesar el uso de lentes 3. Cuando una lente de contacto se coloca en el ojo, el coeficiente de fricción entre el material de la lente y la superficie ocular se ha demostrado que cambiar 4. Hay evidencias que sugieren que los síntomas de sequedad podrían estar relacionados con esta fricción alterada 2,5,6.
Esta asociación también se puede reflejar en los fenómenos clínicamente observables, especialmente wi tapapor epiteliopatía (LSA), también llamado margen del párpado superior tinción (ULMS) 6. LSA es una señal temprana de la irritación ocular y un predictor potencial para la enfermedad del ojo seco. Se observa y se mide por la tinción vital de las regiones borde del párpado superior e inferior. Si bien este sistema de clasificación 2 y su validez clínica (es decir, la correlación con síntomas subjetivos) están siendo objeto de debate, molestia ocular sigue siendo un enigma para los médicos y científicos por igual y, sobre todo, un inconveniente para los pacientes.
Hasta la fecha, poco se sabe acerca de las variaciones clínicamente relevantes en el (sub) la anatomía y la fisiología celular de la zona del limpiaparabrisas tapa 7 y un único informe hace uso de métodos citológicos 8. La citología de impresión (IC) ha sido empleado durante más de 40 años para recoger las células de la superficie epitelial de la conjuntiva tarsal bulbar o mediante la aplicación de una membrana de 9,10. Tras la retirada, las células adherentes se someten a ctinción ytological y de imágenes microscópicas. Debido a las diferencias anatómicas y celulares de la región de limpiaparabrisas tapa, esta técnica requiere la optimización.
Protocol
Representative Results
Discussion
La citología de impresión se lleva a cabo normalmente en la conjuntiva bulbar, utilizando membranas de ésteres mixtos de celulosa. Las muestras se cortan a tamaño de las hojas de material a granel, esterilizar, aplicar y retirar de la superficie conjuntival usando fórceps. Utilizando el mismo material de la membrana, un dispositivo de IC pistón controlado fue diseñado recientemente para que coincida con la geometría de la superficie de la conjuntiva bulbar, y mantener una presión constante entre las aplicacione…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge our colleague Dr. Jalaiah Varikooty who provided insight and expertise on the topic of the lid wiper, that greatly assisted this research.
Materials
| Alcian Blue, 1% in 3% Acetic Acid | Sigma | B8438-250ML | |
| Hematoxylin, Gill 1 | Sigma | GHS116-500ML | |
| Papanicolaou stain, OG-6 | Sigma | HT40116-500 ml | |
| Papanicolaou stain, Modified EA | Sigma | HT40232-1L | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies | L-3224 | contains ethidium homodimer-1 and Calcein AM dyes |
| Alcaine (0.5% proparacaine hydrochloride) | Alcon | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 12 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | EMD Millipore | PICM01250 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
References
- Barbato, G., et al. Diurnal variation in spontaneous eye-blink rate. Psychiatry Res. 93, 145-151 (2000).
- Korb, D. R., et al. Lid-Wiper Epitheliopathy and Dry-Eye Symptoms in Contact Lens Wearers. Eye & Contact Lens. 28, 211-216 (2002).
- Dumbleton, K., Woods, C. A., Jones, L. W., Fonn, D. The impact of contemporary contact lenses on contact lens discontinuation. Eye & Contact Lens. 39, 93-99 (2013).
- Roba, M., Duncan, E., Hill, G., Spencer, N., Tosatti, S. Friction measurements on contact lenses in their operating environment. Tribol Lett. 44, 387-397 (2011).
- Sickenberger, W., Pult, H., Sickenberger, B. LIPCOF and contact lens wearers: a new tool to forecast subjective dryness and degree of comfort of contact lens wearers. Contactologia. 22, 74-79 (2000).
- Pult, H., Purslow, C., Berry, M., Murphy, P. J. Clinical tests for successful contact lens wear: relationship and predictive potential. Optom Vis Sci. 85, E924-E929 (2008).
- Doughty, M. J. Morphological features of cells along Marx’s line of the marginal conjunctiva of the human eyelid. Clin Exp Optom. 96, 76-84 (2013).
- Jalbert, I., et al. Assessing the human lid margin epithelium using impression cytology. Acta Ophthalm. 90, e547-e552 (2012).
- Nelson, J. D. Impression cytology. Cornea. 7, 71-81 (1988).
- Egbert, P. R., Lauber, S., Maurice, D. M. A simple conjunctival biopsy. Am J Ophthalmol. 84, 798-801 (1977).
- Wilson, T. . Confocal microscopy. , 1-64 (1990).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Tomlins, P., Roy, P., Curnow, J., Rauz, S. Assessment of the EyePRIM Device for Conjunctival Impression for Flow Cytometry. Invest Ophthalm Vis Sci. 54, 5430-5430 (2013).
- Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Res Proj Dry Eye Syn. 45, 108-122 (2010).
- Knop, E., et al. The lid wiper and muco-cutaneous junction anatomy of the human eyelid margins: an in vivo confocal and histological study. J Anat. 218, 449-461 (2011).
- Christensen, J. A., Skaarland, E. Nuclear and cell area measurements in the cytological evaluation of pleural effusions: a study of subjective assessments and morphometric measurements. Diag Cytopathol. 3, 50-54 (1987).
